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肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。其中,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最常见的组织学类型,约占肺癌的85%。近年来,我国NSCLC发病率大幅提高,给人民健康造成了极大的威胁。由于NSCLC初期无明显症状,很大一部分患者在确诊时已经处于晚期,而放化疗对改善晚期NSCLC患者的生存期作用相对有限。随着精准医疗时代的来临,驱动基因指导下的分子分型靶向治疗已成为治疗晚期NSCLC的关键性医疗手段。但我国仍有很大一部分患者并未检测到已知的驱动基因,因此进一步探讨NSCLC发生发展的分子机制,对寻找关键的临床治疗靶点具有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是指长度超过200 nt且不具有明显蛋白质编码能力的功能性RNA分子。lncRNA在大多数情况下由RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)转录形成,与mRNA有许多共通的特征,也表现出一些独特的属性。已发现lncRNA在多种类型的肿瘤中异常表达,而一系列表达失调的lncRNA可通过与其他分子的相互作用在致癌/抑癌途径中充当上游调节剂或下游效应子。尽管近年来lncRNA和肿瘤关系的研究取得了很大进展,但是仍有相当一部分lncRNA的功能及作用机制未知,亟需进一步深入研究。人抑制素(Prohibitin,PHB,也称 PHB1,UniProtKB-P35232)在多种类型的肿瘤中异常表达。近十年来,关于PHB1蛋白在恶性肿瘤中的作用存在争议。新近研究显示,膜定位的PHB1对MAPK信号通路发挥重要的调控作用,为K-Ras介导的C-Raf激活所必需。通过其特异性抑制剂Rocaglamides或siRNA可以显着减缓肿瘤的生长,表明抑制PHB1活性可能是一种有前途的癌症治疗策略。已知lncRNA可通过与蛋白质的相互作用来参与信号途径调节,是否存在通过RNA-蛋白质相互作用参与K-Ras:C-Raf:PHB1互作激活的lncRNA尚未见报道,而这些潜在调控关系的发掘,将对寻找有效的预后指标和治疗靶点,实现NSCLC患者的个体化治疗,提高NSCLC患者的生存和生活质量有重要意义。本课题组前期送检了 3对肺腺癌和癌旁正常组织标本的lncRNA芯片,依据芯片数据筛选出一个新的反义lncRNA LOC101929897,并将其命名为IKBKB AS。体内外功能获得/缺失实验及分子机制研究结果显示:IKBKBAS能够作为分子海绵,与IKKβmRNA竞争结合miR-4741,在转录后水平上调并激活IKKβ,进而激活经典的NF-κB信号途径,最终促进肺腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。在已肯定IKBKBAS对NF-κB信号通路的正调控作用基础上,考虑到lncRNA往往同时具有多种调控功能,我们进一步研究了 IKBKBAS在肺腺癌中扮演的角色。本研究以肺腺癌细胞系为研究对象,在多层面进行功能和分子机制的研究,取得了如下结果:我们利用RNA pulldown结合质谱分析、数据库预测检测IKBKBAS可能的互作蛋白,发现IKBKBAS可能靶向PHB1。通过RNA pulldown和RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP)实验证明 IKBKBAS与PHB1能够结合。由于PHB1的生物学效应具有组织特异性,而在肺腺癌中没有系统的研究。我们首先检测了 PHB1在肺腺癌组织细胞中的基础表达量。检测结果显示,PHB1在肺腺癌组织、细胞中显着上调。生存分析显示,PHB1高表达与肺腺癌患者的不良预后密切相关。我们运用平板克隆形成,Transwell小室,CCK8等多种实验进一步探究了 PHB1在肺腺癌细胞中的生物学功能。平板克隆形成实验显示:PHB1过表达组细胞克隆的大小及数量与对照组相比明显增多,而转染si-PHB1的H1299以及HCC827细胞,其细胞克隆的大小及数量与对照组相比明显减少。后续的CCK8实验显示,PHB1过表达明显促进BEAS-2B细胞的增殖,而转染si-PHB1的H1299细胞和HCC827细胞,其增殖能力与对照组相比明显被抑制。Transwell实验显示:PHB1过表达促进BEAS-2B细胞侵袭、迁移能力。相反,敲除PHB1后显着抑制了 H1299细胞和HCC827细胞的侵袭、迁移能力。以上结果证明,PHB1促进肺腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移。Spearman相关性分析结果表明在肺腺癌组织中IKBKBAS与PHB1蛋白表达水平呈正相关。Western Blot实验结果显示PHB1蛋白在IKBKBAS过表达的A549细胞中表达上调,而在IKBKBAS敲低的HCC827细胞中被显着抑制。后续的免疫荧光数据提示,IKBKBAS和PHB1蛋白表达水平存在正相关性。然而,我们并未发现IKBKBAS和PHB1 mRNA表达水平之间的相关性。目前已经证实,IKBKBAS能够促进肺腺癌细胞的侵袭、迁移。我们运用拯救实验探究PHB1是否参与介导IKBKBAS促进肺腺癌细胞恶性进展的作用。平板克隆形成实验显示:由过表达IKBKBAS所引起的A549细胞克隆形成能力的增强可被敲除PHB1所部分逆转,而由敲除IKBKBAS所引起的HCC827细胞克隆形成能力的减弱,可被过表达PHB1所部分逆转;Transwell实验显示:由过表达IKBKBAS所引起的A549细胞侵袭、迁移能力的增强可被敲除PHB1所部分逆转,而由敲除IKBKBAS所引起的HCC827细胞侵袭、迁移能力的减弱,可被过表达PHB1所部分逆转;CCK8实验显示:由过表达IKBKBAS所引起的A549细胞增殖能力的增强可被敲除PHB1所部分逆转,而由敲除IKBKBAS所引起的HCC827细胞增殖能力的减弱,可被过表达PHB1所部分逆转。以上结果显示:IKBKBAS可通过PHB1促进肺腺癌细胞恶性进展。上述实验已经证明PHB1至少部分介导IKBKBAS促进肺腺癌细胞增殖、侵袭、迁移的效应,我们拟进一步探究其内在的分子机制。我们在肺腺癌细胞A549中过表达IKBKBAS,可抑制PHB1的核转位,增加细胞质膜PHB1含量,并可增强C-Raf/MEK/ERK的磷酸化级联激活,该效应可被敲除PHB1衰减;而在肺腺癌细胞HCC827中敲除IKBKBAS,则可抑制C-Raf/MEK/ERK的磷酸化级联激活,该效应可被过表达PHB1部分逆转。以上结果显示,IKBKBAS通过抑制PHB1的核转位,促进PHB1的膜易位过度激活MAPK信号通路,进而促进肺腺癌细胞增殖、迁移以及克隆形成能力等恶性行为。前期结果显示IKBKBAS在蛋白水平而非mRNA水平上调PHB1,且IKBKBAS和PHB1存在相互作用,推测IKBKBAS通过结合PHB1,抑制其泛素化降解而增加了 PHB1的蛋白稳定性。我们使用蛋白质合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide,CHX)处理A549细胞,Western Blot检测结果显示,过表达IKBKBAS后PHB1蛋白的半衰期明显延长。MG132实验显示IKBKBAS抑制PHB1蛋白的泛素一蛋白酶体途径降解。为研究IKBKBAS是否参与了 PHB1的泛素化过程,我们向HEK293T细胞中共转染以下两组质粒后行IP实验:①:pCDNA3.1-IKBKBAS+p-ENTER-PHB1+pCDNA3.1-UB;②:pCDNA3.1+p-ENTER-PHB 1+pCDNA3.1-UB;IP实验结果显示IKBKBAS过表达能够稳定PHB1蛋白,抑制其泛素化水平。我们进一步探究了 IKBKBAS调控PHB1泛素化水平的分子机制。通过数据库预测以及结合已有文献报道,SKP2B为靶向PHB1的E3泛素连接酶。Co-IP实验证明在肺腺癌细胞A549中两个蛋白存在内源性结合,且过表达IKBKBAS能够抑制PHB1与SKP2B的结合。以上结果证明:IKBKBAS抑制SKP2B介导的泛素化降解稳定PHB1蛋白。结论:在正常细胞中,PHB1与SKP2B结合,被SKP2B介导泛素化修饰并经蛋白酶体途径降解。而在肺腺癌细胞中,IKBKBAS过表达,与PHB1的结合抑制SKP2B介导的泛素化降解从而上调PHB1蛋白丰度,PHB1向膜易位增加从而过度激活MAPK信号通路,促进肺腺癌的恶性进展。