论文部分内容阅读
背景与目的：卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,严重危害女性健康。治疗以手术为主,化疗为辅。目前临床应用较广的是以铂类为主的联合化疗,由于耐药和复发的产生,卵巢癌患者的死亡率居高不下,位居三大恶性肿瘤之首。所以卵巢癌铂类耐药产生的机制成为研究热点。基因突变或缺失是多种恶性肿瘤发生的根源,有研究发现肝癌缺失基因1(DLC1)在多种肿瘤中低表达或不表达,通过调节黏着斑激酶(FAK)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等影响肿瘤细胞的凋亡,转染外源性DLC1基因可抑制肝癌细胞的增殖,促进凋亡。已有研究发现FAK、MAPK蛋白相关信号通路在卵巢癌细胞的增殖和凋亡过程中发挥重要作用,而其上游调控因子之一DLC1在卵巢癌中的表达及作用等研究甚少,本实验用DLC1基因转染该基因表达缺失的人卵巢癌多药耐药细胞系OVCAR-3细胞,观察转染前后卵巢癌细胞内凋亡通路相关因子FAK、p38MAPK(后简称p38)总蛋白表达和磷酸化水平的变化及其与DLC1蛋白表达的相关性,测定转染前后细胞凋亡率及周期分布的变化,计算转染前后细胞对顺铂耐药性的变化,进一步分析DLC1基因对OVCAR-3细胞顺铂耐药性的影响及其可能的作用机制。方法：将OVCAR-3细胞分为3组,空白组为未经处理的OVCAR-3细胞,阴性对照组OVCAR-3细胞转染空质粒pEGFP-C3,实验组OVCAR-3细胞转染重组质粒pEGFP-C3-DLC1。RT-PCR法检测转染前后OVCAR-3细胞中DLC1基因表达变化,Western blotting方法检测各组细胞中DLC1、FAK、磷酸化FAK(p-FAK)、p38和磷酸化p38(p-p38)蛋白的表达变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定不同顺铂浓度梯度下A492值,计算转染前后不同顺铂浓度梯度下OVCAR-3细胞的生长抑制率和对顺铂的半数抑制浓度(IC50),流式细胞仪测定顺铂处理前后各组细胞凋亡率及周期分布改变,p-FAK、p-p38蛋白的表达水平变化与各组细胞对顺铂IC50的关系行Pearson相关性分析。结果：DLC1基因和蛋白在实验组表达而在空白对照组和阴性对照组均未见表达,实验组细胞与其余2组细胞相比,对顺铂的IC50 (μmol/L)较低(4.02 vs 4.99/4.90, P=0.00), p-p38/β-actin蛋白表达上升而p-FAK/β-actin蛋白表达下降(3.02 vs 1.52/1.61,3.13 vs 9.03/8.99, P=0.00),顺铂处理前后实验组与其余2组细胞相比凋亡率增加(8.97% vs 1.81%/1.95%,30.68% vs 18.03%/20.33%, P =0.00), G1期细胞比例增加(65.80% vs 60.82%/59.80%,66.48% vs 55.42%/53.94%,P=0.00。p-FAK蛋白的表达水平与3组细胞对顺铂的IC50呈正相关(r=0.89,P=0.00), p-p38蛋白的表达水平与3组细胞对顺铂的IC50呈负相关(r=-0.90,P=0.00)。结论：OVCAR-3细胞内未见DLC1基因及蛋白的表达,转染外源性DLC1基因可使OVCAR-3细胞G1期的比例相对增加,早期凋亡率升高,对顺铂敏感性增加。DLC1基因逆转OVCAR-3细胞顺铂耐药的作用可能依赖于细胞内外源性DLC1基因的重新表达及p-FAK的表达降低和p-p38的表达增强。