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多能干细胞的发展为再生医学、疾病模型和药物筛选等研究提供了理想的研究材料。由于猪的生理结构和器官大小与人接近,饲养较为容易,是理想的实验动物模型。猪多能干细胞的建系工作进展与人和小鼠相比非常缓慢,其难度主要在于未寻找到适合猪多能干细胞的培养条件。本研究以药物介导外源基因表达的猪iPS细胞为材料,通过筛选以确认能够维持猪i PS细胞自我更新的培养体系。实验结果如下:1.猪DOX-iPS细胞的建立和鉴定以强力霉素（Doxycycline,Dox）介导的慢病毒表达载体（携带四串联表达的鼠源四因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）转导猪胎儿成纤维细胞后,通过在添加Dox的LF2i培养基中培养5-7天后,可获得小鼠ES细胞样克隆。通过挑取和筛选,获得了三株形态立体、边缘整齐、AP染色阳性的DOX-iPS细胞克隆。经检测,三株DOX-iPS细胞的基因组中钧有FUW-TetO-OSKM和FUW-M2rtTA结构插入、表达特定的多能基因、OCT4和SOX2蛋白高表达且定位于细胞核、SSEA-1蛋白定位于细胞膜、NANOG蛋白的表达不明显。进一步鉴定结果表明,三株DOX-iPS细胞染色体数正常（36+XY）,细胞经悬浮培养后可形成类胚体,类胚体自发分化的细胞表达三胚层特异标记物AFP、TUJ1和DESMIN。上述结果表明,诱导得到的三株猪DOX-iPS细胞均表达多能相关基因,可在体外分化成三胚层细胞,具备了基本的多能性。2.建立Dox调控的细胞重编程体系Dox可调控外源多能基因的表达,为检测猪DOX-iPS细胞受Dox调控的作用,在培养基中添加或撤除Dox,观察细胞多能性状态的变化情况。当Dox从LF2i培养基中撤除后,DOX-iPS细胞的克隆形态逐渐消失,再将培养基中的细胞因子撤除后,DOX-iPS细胞完全分化为AP染色阴性的成纤维样细胞。分化的细胞(DOX-i PSdiff)基因组中仍保留插入的外源元件,且成纤维细胞标记基因的表达量随细胞分化程度而提高。将分化的细胞重新置于含有Dox的LF2i培养基中培养4天,AP阳性克隆重新产生,形成的二代DOX-iPS细胞(DOX-iPS2nd)克隆可继续传代并保持原有的克隆形态。二代i PS细胞表达外源和内源多能基因,与一代DOX-iPS细胞无明显差异。本实验建立了Dox调控的细胞重编程体系,通过添加或撤除Dox,调控DOX-iPS细胞的多能状态。该体系为筛选猪i PS培养条件提供了实验条件。3.筛选和建立猪iPS的2i培养条件我们利用上述Dox调控的DOX-iPS体系,对维持猪PSCs多能性的培养条件进行了筛选。与LF2i培养条件相比,在2i培养条件中撤掉LIF、b-FGF、CHIR99021和SB431542后发现,LIF和b-FGF的撤除使得iPS克隆形态更为立体,AP着色更深,内源OCT4、SOX2和NANOG的表达量更高。随后,将DOX-iPSdiff细胞分别置于LF2i和2i培养条件中进行诱导重编程后发现,LF2i条件下克隆形成效率更高,克隆形态较好,而2i条件下克隆数量较少且无法长期传代。再用LF2i和2i培养条件对PEF细胞进行重编程诱导时,也得到了类似结果,说明单独的2i培养条件尚不能有效进行细胞重编程。此结果显示,猪体细胞重编程的起始阶段需要LF2i培养条件,但是,在猪多能干细胞阶段就不需要LIF和b-FGF,而2i培养条件即可有效维持iPS细胞的多能状态,前提条件是需要有Dox的存在。4.3i培养条件的建立2i培养条件可提高DOX-iPS细胞内源多能基因的表达水平,但是iPS细胞的自我更新仍依赖Dox介导的外源基因表达。我们尝试通过在2i培养体系的基础上添加不同的细胞因子和小分子,激活内源基因的表达,从而维持DOX-iPS细胞自我更新的能力。在2i体系中添加BMP4、SCF、IL-6,并同时添加血小板裂解物（Platelet Lysates,PL）以替代血清后,DOX-iPS细胞内源OCT4和NANOG表达显著提高;撤除Dox后,部分i PS克隆仍能维持AP阳性状态,但持续传代能力较差。因此,我们在新的培养体系中再加入小分子PD0325901,使DOX-iPS细胞能够在撤除Dox条件下维持较好的克隆形态和较高的内源多能基因表达。此培养条件即为3i培养条件。将不同来源的猪多能干细胞在3i条件中培养,均能维持其自我更新能力,且内源多能基因的表达有不同程度的提高。以上结果表明,我们通过筛选建立了全新的无Dox无LIF/bFGF无血清的3i培养条件,该条件可维持猪PSCs的自我更新能力。