马氏珠母贝壳基质蛋白基因的克隆和表达模式研究

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马氏珠母贝是最重要的海水珍珠贝,然而至今还不能从分子水平彻底阐明珍珠的形成。珍珠的形成属于生物矿化过程(biomineralization),是由一系列基质蛋白指导CaCO3结晶的过程,但关于它们在分子水平上的作用机理,多个基质蛋白相互之间的关系,与其他物种相关蛋白之间的进化关系,表达水平的调控,目前的研究成果都无法给与充分的解释。本实验主要完成2方面的工作:(1)考察多种环境因子对马氏珠母贝一种重要基质蛋白基因表达模式的影响;(2)发现一种新的壳基质蛋白,并进一步预测和分析其结构和功能。我们拟通过开展这样的工作,为研究贝壳和珍珠的形成机理做出初步的研究。利用5’RACE技术,克隆出一种马氏珠母贝壳基质蛋白基因的cDNA全长,通过预测该蛋白质序列,发现其N端含有一段19个氨基酸组成的信号肽,含有典型的Gly-rich区和C端RKKKY保守序列,同源性分析表明,这是一个新发现的Shematrin家族成员,和Shematrin-2同属一个亚家族,故命名为Shematrin-2β。进一步的比对发现,Shematrin-2β和MSI7有着局部高度匹配的区域,推测二者在进化上有着特殊的关系。氨基酸组分分析表明,Shematrin-2β可能会赋予壳和珍珠特殊的机械属性,参与生物矿化过程中支架蛋白的构建,同时还能够介导其他蛋白质参与矿化过程。RT-PCR显示,Shematrin-2β基因在外套膜边缘和缘膜处均有表达,暗示该基质蛋白可能在珍珠层和棱柱层的构建中均有作用。这一研究成果,填补了Shematrin家族的空缺,对进一步研究该家族与生物矿化的关系有着一定的意义。采用中心复合设计等方法,考察温度和盐度,Ca2+和Mg2+对马氏珠母贝红壳色选育系Nacrein基因表达量的联合影响。结果显示:(1)温度和盐度的一次效应对Nacrein基因表达有显著影响(P<0.05),二次效应有极显著影响(P<0.01),但二者间互作效应不显著(P>0.05)。通过对模型的优化,得到的最优表达温盐组合为26.1℃,30.6ppt,此时相对表达量最大为0.509,模型满意度为100%。通过设计一组Ca2+浓度梯度和Mg2+浓度梯度,考察Ca2+和Mg2+对马氏珠母贝红壳色选育系Nacrein基因表达量的联合影响。结果显示,基因表达量随着Ca2+浓度的增加而显著升高,Ca2+浓度的一次效应和二次效应极显著(P<0.01)。在上述处理的基础上,每组加入等量的Mg2+,结果发现,Mg2+处理前后基因表达量也存在着显著差异,Mg2+浓度的一次效应极显著。但二者的互作效应不显著(P>0.05)。这表明,一定浓度范围内,Ca2+和Mg2+对Nacrein基因的表达有着明显地促进作用,并且存在着一个最适Ca2+浓度。
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