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目的:PERK通过活化下游e IF2α和Nrf-2两条信号通路发挥促凋亡或抗凋亡效应,PERK内质网应激通路活化通过调节细胞凋亡参与多种疾病的发病。新近研究表明糖尿病肾病存在内质网应激及PERK/e IF2α通路活化,然而,PERK/e IF2α通路活化与肾组织细胞凋亡间的关系尚不明确。本研究在证明糖尿病肾组织存在GRP78/PERK/e IF2α内质网应激信号通路活化,以及组织细胞凋亡增加的前期工作基础上,拟采用RNA干扰技术下调e IF2α和Nrf-2基因表达,通过体外实验旨在明确:⑴糖尿病肾组织细胞凋亡与PERK/e IF2α和(或)PERK/Nrf-2信号通路活化的关系;⑵高糖和血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞凋亡,是否依赖PERK/e IF2α和(或)PERK/Nrf-2信号通路活化;⑶e IF2α和Nrf-2何为诱导凋亡的关键分子。本项目的意义在于为糖尿病肾病治疗筛选新的有效的分子干预靶点。方法:体外培养肾小管上皮细胞(NRK-52E),分别单独转染e IF2α-si RNA、Nrf-2-si RNA慢病毒载体,用荧光显微镜观察转染效率,确定MOI值。转染后的NRK-52E细胞加入高糖(30mmol/L)和不同浓度血管紧张素Ⅱ(10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)刺激,观察时间点为12h、24h、48h,用流式细胞术检测细胞凋亡,筛选出血管紧张素Ⅱ的最佳作用浓度和最佳作用时间。实验分为四组:正常对照组(血糖5.5mmol/L)、高糖和血管紧张素Ⅱ刺激组、高糖和血管紧张素+Ⅱ空载体组、高糖和血管紧张素+Si RNAⅡ组。通过免疫组化和Western blot方法检测肾小管细胞e IF2α、p-e IF2α,Nrf-2表达水平,采用TUNEL方法检测肾小管细胞凋亡。结果:1.荧光显微镜下可见大量绿色荧光表达,转染效率至少在80%以上,MOI值为10。2.流式细胞术筛选出血管紧张素Ⅱ的最佳作用浓度为10-7mol/L,最佳作用时间为24小时。3.免疫组化和Western blot已经证实,正常情况下NRK-52E细胞中存在e IF2α和Nrf-2的表达。在加入高糖、血管紧张素Ⅱ诱导细胞凋亡后,p-e IF2α的表达明显增加(p<0.05),在e IF2α-Si RNA干扰后,e IF2α、p-e IF2α的表达明显受抑制(p<0.05)。在Nrf-2-Si RNA干扰后,Nrf-2的表达明显受抑制(p<0.05)。4.TUNEL结果中加入高糖、血管紧张素Ⅱ后NRK52E细胞凋亡增加,在e IF2α-Si RNA干扰后,细胞凋亡较正常对照组和高糖、AngⅡ组明显减少(p<0.05);在Nrf-2-Si RNA干扰后,细胞凋亡较正常对照组和高糖、AngⅡ组明显增加(p<0.05)。结论:1.正常情况下,NRK52E细胞中存在e IF2α和Nrf-2的表达,PERK/e IF2α信号通路在ERS反应中发挥促凋亡作用,PERK/Nrf-2信号通路在ERS反应中发挥抗凋亡作用。2.高糖、血管紧张素Ⅱ诱导NRK-52E细胞凋亡可能依赖于PERK/e IF2α和PERK/Nrf-2信号通路活化。