背景急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是常见的血液系统恶性肿瘤,占成人急性白血病的80%-90%,发病率约为4.3/10万且随着年龄的增加而上升,65岁以上老年人发病率已超过20.1/10万。AML诱导治疗完全缓解率为60-80%,但复发率高达50%-70%,5年总生存率仅为30%-40%,是死亡率最高的血液系统恶性肿瘤。除特殊亚型急性早幼粒细胞白血病使用维甲酸联合亚砷酸诱导分化治疗之外,目前化疗仍是其他亚型AML患者的主要治疗方式,符合条件者可以选择联合分子靶向治疗或者序贯异基因造血干细胞移植,但除部分接受异基因造血干细胞移植的AML患者外,其余大部分AML患者缓解深度有限,体内尚未被清除的微小残留病变（Minimal residual disease,MRD）最终会导致病情复发和患者死亡,这是当前基础科学研究和实际临床工作中均亟待解决的关键问题。细胞衰老是指当细胞遭受内外各种非致命性损伤时的一种反应,致使其在脱离正常细胞周期并丧失增殖能力之后进入一种相对稳定且持续静止的状态。其中,应激性早衰是指在各种应激因素刺激下提前诱发的非端粒依赖性的细胞衰老方式,有别于端粒依赖性的复制性衰老,其早期被认为是机体为维护基因组稳定性而做出的保护性反应机制和阻止肿瘤发生发展的重要天然屏障。但近年越来越多研究表明,肿瘤细胞在化疗药物等应激下,可以主动借助应激性早衰这一机制进入“老而不死”的暂时“休眠”状态来抵抗化疗并介导复发,而且不依赖于任何分子遗传学改变,其主要作用途径为细胞周期阻滞和衰老相关分泌表型。“SENEX”一词源于拉丁文“老人”,故“SENEX基因”又称为“衰老基因”,其在Refseq系统中被命名为ARHGAP18,定位于人6号染色体长臂（6q22.33）,总碱基长度为2901bp,编码蛋白含有663个氨基酸残基,分子量约为75KD,在人体各种组织和器官中广泛分布,可作为细胞信号转导的“分子开关”快速感知细胞应激而活化细胞信号通路,从而调控众多关键基因表达而维持细胞生存。研究发现过表达SENEX基因可以诱导血管内皮细胞、调节性T细胞以及淋巴瘤细胞等出现典型的应激性早衰形态特征,并发生细胞周期阻滞和衰老相关分泌表型,从而抵抗对外界应激因素诱导的细胞凋亡。然而,目前尚未见其他课题组报道SENEX基因在AML中的表达、功能以及作用机制,也鲜见有研究报道应激性早衰在AML中的发生及其作用。本课题组前期发现AML患者体内SENEX基因转录水平表达升高,尤其是在化疗后未缓解时升高更显著,提示SENEX基因可能参与AML耐药,本研究拟从应激性早衰这一途径来进一步探讨和分析SENEX基因在AML复发中的作用及其具体机制,以期为阐明AML复发机制提供实验依据。方法临床标本实验:收集我科收治的初诊AML患者16例、缓解AML患者20例、复发难治AML患者18例以及对照组缺铁性贫血患者19例,分别留取各组患者的外周血和骨髓标本,同时还留取上述部分外周血MRD阳性的复发难治AML患者正在行化疗过程中的外周血标本。利用瑞吉染色对AML患者细胞涂片标本进行染色,观察白血病细胞及其在化疗应激情况下的形态特征;β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）直接形态染色和结合流式细胞术（FCM）检测,分析AML患者白血病细胞及其在化疗应激情况下的衰老比例;单细胞测序检测RNA-seq表达,分析AML患者白血病细胞亚群衰老基因表达情况;实时定量PCR（q PCR）和Western Blot检测SENEX基因m RNA和蛋白,分析AML患者体内SENEX基因在转录水平和翻译水平的表达特征及其与患者复发相关性;生物信息学分析SENEX基因在AML中的转录水平表达及其预后意义。体外细胞系实验:利用阿糖胞苷体外诱导AML细胞系KG-1a构建应激性早衰的细胞模型,然后瑞吉染色观察细胞形态变化,SA-β-Gal直接形态染色和结合FCM检测分析细胞衰老比例变化,CCK-8检测分析细胞增殖率变化,FCM检测分析细胞凋亡比例变化,FCM检测分析细胞周期变化,微球法（CBA）检测细胞因子分析衰老相关分泌表型,q PCR检测细胞SENEX基因转录水平表达变化,Western Blot检测SENEX基因翻译水平表达变化。然后通过si RNA慢病毒稳定转染技术沉默KG-1a细胞系中SENEX基因,再同样利用阿糖胞苷体外诱导KG-1a细胞,并检测和分析其在SENEX基因沉默后在形态、增殖、衰老、凋亡、周期以及分泌表型等生物学行为的变化。结果临床标本实验:我们对临床上复发难治AML患者进行实验分析后发现,较之初诊AML患者和缓解AML患者,复发难治AML患者在化疗后残留下来的白血病细胞瑞吉染色显示体积显著增大且染色加深,同时无论是形态学直接染色还是FCM分析均显示细胞衰老特异性的SA-β-Gal染色阳性细胞比例明显增多,尤其是复发难治AML患者在化疗过程中SA-β-Gal染色阳性细胞比例更是显著增多。我们留取复发难治AML患者化疗后耐药时的骨髓标本,充分验证其发生高比例应激性早衰后进行了单细胞测序检测RNA-seq表达分析,结果发现与其他细胞亚群相比白血病细胞亚群中衰老相关基因表达显著上调。我们还发现,与缺铁性贫血对照组和缓解组AML患者比较,初诊和复发难治组AML患者体内SENEX基因在转录水平和翻译水平均显著表达增高,生物信息学数据也进一步证实AML中SENEX基因转录水平显著升高且与患者不良预后密切相关。体外细胞实验:我们使用AML细胞系KG-1a进行了体外诱导实验,结果发现KG-1a细胞在10μM浓度的阿糖胞苷连续作用3天和每天2小时间断作用6天条件下,与没有药物干预的0天基线比较,阿糖胞苷作用后KG-1a细胞数量明显减少,增殖率显著下降,凋亡比例显著增多,且6天实验组较3天实验组变化更明显,但阿糖胞苷无论是作用3天还是作用6天后,均仍有部分白血病细胞能够耐药存活且呈现为应激性早衰表型,其在形态学上体积增大和染色加深,形态学和FCM分析SA-β-Gal衰老染色阳性细胞比例均显著增多。同时,我们对上述阿糖胞苷诱导的KG-1a细胞进行了细胞周期分析,结果发现其呈现为典型的周期阻滞状态,同时我们还进行了分泌型细胞因子检测,结果发现与衰老相关的IL-8/IL-6/IL-1β等均较0天基线数据明显上调。此外,我们通过细胞信号蛋白分析发现阿糖胞苷诱导KG-1a细胞后,与衰老相关的信号蛋白p53、p21、p16、Rb等也显著表达升高。接下来,我们通过si RNA慢病毒稳定转染技术沉默KG-1a细胞系中SENEX基因,发现当沉默KG-1a细胞中SENEX基因后再利用阿糖胞苷诱导,结果显示没有沉默SENEX基因的对照组KG-1a细胞应激性早衰比例高,衰老相关蛋白表达高,但是凋亡比例低,解除阿糖胞苷应激后继续培养能恢复细胞增殖,最终摆脱化疗药物的致命性杀伤;而沉默SENEX基因的实验组KG-1a细胞应激性早衰比例低,衰老相关蛋白表达高,但是凋亡比例高,解除阿糖胞苷应激后继续培养不能恢复细胞增殖,最终死于化疗药物的致命性杀伤。结论AML患者在复发难治状态下高比例发生应激性衰老及其相关周期阻滞和分泌表型,并伴随SENEX基因表达水平显著增高;SENEX基因在AML细胞体外受到化疗药物应激时表达增高且诱发AML细胞发生应激性早衰介导耐药和复发。