背景:随着社会人口老龄化和脑血管病发病率升高,认知障碍的患病率和致残率快速上升,65～85岁人群中认知障碍的发生率为25%,85岁以上可高达65%。血管性痴呆(vasculardementia,VD)是由多种复杂脑血管危险因素造成,是伴有认智能损害和知功能障碍的慢性退行性疾病,具有获得性和持续性的特点。VD是仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的可导致认知功能障碍第二大神经系统疾病,给个人、家庭和公共医疗体系造成了沉重的经济负担。颈动脉狭窄导致脑血流供应不足等脑血管危险因素均与VD认知功能障碍关系密切。慢性脑血流低灌注导致的脑白质损伤和认知功能障碍在老年人中非常普遍,严重影响其生活质量。由于缺乏明确的分子机制和药物靶点,临床治疗VD多采用促进胆碱能系统功能的药物及改善脑代谢药物等进行对症治疗,但这些药物能否延缓大脑功能全面衰退或逆转痴呆病程还有待长期随访观察。由此,对痴呆的防治仍是今后医药研究领域面临的严峻挑战,亟需对血管性痴呆的机制进行深入研究,探寻发现新的药物靶标。VD的发病机制是国际上神经系统疾病研究热点之一。慢性脑血流低灌注导致脑葡萄糖和氧气供应长期不足,最终可造成海马部位神经元病理生理改变,如膜磷脂代谢障碍、氧自由基过多生成、过量兴奋性氨基酸释放、细胞内钙超载等,这些因素作用的综合结果是导致该部位胆碱能神经元损害,星胶质细胞肥大和增生,小胶质细胞激活,伴有脑白质病理性损伤,由此患者最终出现认知功能障碍。VD患者人群由于病因的多样性和病程放的不同,导致抽样可控性差,其病理生理机制不同,建立统一的临床病例纳入和排除标准不容易。于此相关,如何建立能尽可能模拟VD患者病理过程的动物疾病模型也是需要考虑的重要问题。原有VD动物模型类型庞杂,各自仅模仿VD单方面发病及病生特点,不能较为全面反映VD的特征。近年来,随着分子生物学技术的应用,VD疾病的分子机理有新的揭示,加之转基因模式动物在研究中突出的优势,故探索一种可使颈动脉狭窄引起长期慢性脑血流低灌注小鼠模型,对将来从分子水平认识VD发病机理和开展新药研究尤为关键。钙调蛋白(Calmodulin,CaM)可以激活多种酶或者通道,在神经系统中参与调节神经元的代谢、轴浆运输、突触功能以及递质的合成与释放等。大量研究表明,Ca2+/CaM信号紊乱是介导脑缺血病理进程的重要因素,参与异常激活Ca2+依赖蛋白激酶如磷脂酶A2和钙蛋白酶Calpain,以及Ca2+/CaM依赖酶一氧化氮合酶(NOS)和钙调磷酸酶(calcineurin,CaN)。而磷脂酶A2激活可激发一系列病理过程,比如引起花生四烯酸(arachidonicacid,AA)堆积,从而导致AA在环氧酶及脂氧酶作用下生成前列腺素、白三烯和自由基等活性物质,进而破坏生物膜而引发广泛的炎症反应。其中炎性细胞分泌大量促炎细胞因子如白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumoral necrosis factor-α,TNF-α)和Fas配体(Fasligand),从而引起DNA、蛋白质和磷脂降解,引发缺血性脑损伤。我们前期发现针对上述Ca2+/CaM依存的信号通路进行药物调控也可有效保护急性神经血管单元损伤。虽然CaM抑制剂在缺血性脑血管病的防治研究中显示了其药理作用,但其是否可减缓或控制VD症状及病理过程还未见报道。在上述背景下,本实验将通过选择合适的VD病理模型,探索Ca2+/CaM抑制剂对VD症状及病理过程的干预作用及潜在机制。DY98,3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5,6-二甲氧基-1H-吲唑草酸盐是DY9760e的衍生物,属于吲唑化合物,一个用于治疗急性脑缺血药物,尚未市售。DY98作为钙调素抑制剂,化学结构和药效学作用类似DY9760e。有报道DY9760e可保护微栓塞导致的血脑屏障损害,减轻脑水肿,是一种有效的抗急性脑缺血损伤保护剂。故本研究探索DY98其是否具有治疗VD认知障碍的药理学作用。此外,多聚唾液酸(polysialicacid,PSA)是一种位于细胞表面的,由α-2,8神经氨酸组成的线性的、均一多聚的碳水化合物,神经细胞黏附因子(NCAM)是多聚唾液酸的主要载体。PSA作为一种亲水的、无毒和生物可降解的内源性聚合物,在药物载体中也得到了较为广泛的应用。聚合物胶束具有穿透血脑屏障(BBB)的能力。因此基于聚合物胶束的纳米药物传递系统,有望提高治疗VD药物的疗效,本研究中采用PSA和DY98联合给药也是基于上述目的。本论文主要研究内容框架如下:1)本研究首先参照文献,建立及优化小鼠长期慢性脑血流低灌注血管性痴呆模型。在手术30d后,采用Morris水迷宫评价学习记忆功能。另采用转轮法、旷场实验、高架十字迷宫实验、强迫游泳实验、悬尾实验,对模型小鼠进行运动关联、焦虑和抑郁功能相关的行为学评价。2)合成十八胺修饰聚唾液酸(PSA-ODA),制备载DY98 PSA-ODA胶束,并对其化学特性进行表征。3)采用钙调素抑制剂及其PSA胶束,研究对VD的治疗作用及可能机制。钙调素抑制剂 DY98(1mg/kg)及其 PSA 胶束 PSA+DY98(7+0.25)mg/kg 体重分别灌胃和腹腔注射给药治疗1月后,以Morris水迷宫等方法观察DY98及其PSA胶束对慢性脑缺血致认知损害的改善作用。收集大脑海马组织样本,Western-blot法检测炎症相关STAT1、STAT3、NLRP3蛋白表达的变化。激光共聚焦免疫荧光染色法观察小鼠海马CA1、CA3、DG脑区神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteine-requiring Aspartate Protease 1,Caspase-1)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)活化加工、蛋白质酪氨酸硝基化(nitrotyrosine)表达变化。此外,考察DY98及其PSA胶束对小鼠双侧颈动脉狭窄痴呆模型小鼠海马CaMKⅡ磷酸化水平的影响。通过以上实验研究,取得主要研究结果如下:一、血管性痴呆小鼠模型优化1)小鼠双侧动脉血流阻断及合并硝普钠法,模型小鼠手术前后2h内局部脑血流于对照组相比,差异无统计学意义。术后14-18d和28-32dMorris水迷宫空间记忆功能无损害,提示该模型不成功。2)双侧颈动脉血流阻断20分钟3次,术后7d Morris水迷宫空间记忆功能损害,死亡率很高。双侧颈动脉血流阻断20分钟2次,术后28d Morris水迷宫空间记忆功能损害,死亡率仍高。双侧颈动脉血流阻断10分钟2次,术后28d Morris水迷宫空间记忆功能无损害。提示小鼠双侧颈动脉血流阻断法血管性痴呆模型,均不适合做慢性疾病模型研究使用。3)线圈法致小鼠双侧颈部动脉狭窄法(颈部动脉单侧直径0.18mm)术后30天Morris水迷宫空间记忆损害明显,但死亡率极高,该模型不成功。该方法改为颈部动脉单侧直径0.20mm,存活率72.7%,术后30天开始相关行为学指标检测:Morris水迷宫结果表明其空间记忆损害明显,而运动和平衡功能无影响,强迫游泳试验提示有抑郁样行为表现,旷场实验、高架十字迷宫实验、明暗箱实验结果提示无明显焦虑现象,探究活动能力增强。综合以上实验结果,故本研究表明线圈法致小鼠双侧颈部动脉狭窄法(颈部动脉单侧直径0.20mm)为最优小鼠VD模型。二、PSA-DY98包和物的合成及特性表征分析1)合成的PSA-ODA聚合物具有两亲性特征,当PSA-ODA在水溶液中的浓度高于120μg/mL,可形成聚合物胶束的空间结构。空白胶束的粒径在水相中为145.7±2.08nm,且具有狭窄的粒径分布。透射电子显微镜观察到的PSA-ODA空白胶束的粒径在50 nm左右。PSA的羧基基团的zeta电位为-33.4±2.56 mV。ODA 修饰后,PSA-ODA 胶束的 zeta 电势下降到-21.2±1.01 mV,胶束表面较高的zeta电位,增加聚合物胶束的稳定性。2)DY98从载药胶束中的体外释放具有缓释特征。三、钙调素抑制剂DY98及其PSA包和物对VD小鼠的治疗作用及机制研究采用DY98和其PSA包和物对慢性脑血流低灌注血管性痴呆小鼠药效学评价及海马脑区硝化应激、炎症等相关信号分子机制的探索。主要结果如下:1)药效学研究:与模型对照组小鼠相比,Morris水迷宫空间探索试验中,DY98(1mg/Kg)高剂量处理组、DY98(0.5mg/Kg)低剂量处理组、PSA(7mg/Kg)处理组、PSA+DY98(0.25mg/Kg)处理组上台潜伏期均减少;定位航行试验中,DY98(1mg/Kg)高剂量处理组、PSA(7mg/Kg)处理组上台潜伏期均减少;工作记忆试验中,DY98(1mg/Kg)高剂量处理组、PSA(7mg/Kg)处理组、PSA+DY98(0.25mg/Kg)处理组上台潜伏期均减少。2关联作用机制研究:2.1 DY98(1 mg/Kg)高剂量处理组、PSA(7mg/Kg)处理组、PS A+DY98(0.25mg/Kg)处理组可以改善VD模型组小鼠海马脑区锥体神经元CaMKⅡ磷酸化水平。2.2与模型组小鼠相比,DY98(1mg/Kg)高剂量处理组、PSA(7mg/Kg)处理组、PSA+DY98(0.25mg/Kg)处理组均可抑制NLRP3蛋白表达水平的上调;PSA(7mg/Kg)处理组、PSA+DY98(0.25mg/Kg)处理组均可使造模后上调的STAT3蛋白表达水平下降;DY98(1mg/Kg)高剂量处理组、PSA+DY98(0.25mg/Kg)处理组均可抑制造模后海马区域Nitrotyrosine的阳性表达及caspase-1/IL-1β信号通路的激活。提示DY98及其PSA包和物可减轻慢性脑血流低灌注进程中硝化应激诱发的炎症级联反应所致的血管性痴呆。结论:1)以水迷宫等作为认知功能障碍行为学评价指标,在小鼠双侧动脉血流阻断加硝普钠法、小鼠双侧动脉血流阻断法、线圈法(颈部动脉单侧直径0.18、0.20mm)致小鼠慢性脑血流低灌注血管性痴呆模型中,以线圈法(颈部动脉单侧直径0.20mm)为最优。2)新型钙调素抑制剂DY98和其PSA胶束均显示出对慢性脑缺血低灌注VD模型小鼠学习记忆功能障碍有改善作用。3)首次采用多聚唾液酸作为药物载体负载钙调素抑制剂,并开展药效学研究,发现0.25mg/kg钙调素抑制剂DY98经多聚唾液酸载可以起到高剂量组(1mg/kg)同等药效。提示多聚唾液酸作为药物载体在提高药物效应方面具有潜在的应用价值。4)DY98及其PSA胶束通过减少海马部位Nitrotyrosine过量表达、进而减轻硝化应激损伤和NLRP3/caspase-1/IL-1β关联炎症反应。经由上述机制,DY98及其包合物增加海马锥体神经元CaMKⅡ蛋白磷酸化水平,改善慢性脑缺血低灌注VD模型小鼠学习记忆功能。钙调素抑制剂DY98有望成为治疗VD的候选化合物。综上所述,本研究建立优化了小鼠双侧颈部动脉狭窄VD模型。首次采用钙调素抑制剂DY98及其PSA胶束证实其具有对血管性痴呆病理过程的改善作用。初步阐明DY98药理作用机制与减轻VD小鼠海马部位硝化应激损伤和NLRP3/caspase-1/IL-1β关联炎症反应密切相关。