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乳腺癌为全球女性首发恶性肿瘤,对其生物学研究的重点是在分子水平上发现有效的预后指标及治疗靶点。目前对分子标记应用临床的局限,主要是由于生物分子作用的复杂及相互交叉,因此对于新的生物分子及其在癌细胞中复杂作用机制的探讨,有助于开发出新的有效预后标志物,也会促进乳腺癌综合治疗个体化策略。随着基因测序及生物信息学技术的发展,癌基因组内非编码RNA序列的调控作用与肿瘤复杂生物学特征间的关系研究成为热点。与其他常见肿瘤相似,已有众多研究报道多种长非编码RNA(LncRNA)在乳腺癌中表达异常,与肿瘤的生物学特征或预后相关。LncRNA是的一种长度大于200个核苷酸的非编码RNA,因其具有更为复杂的空间结构,参与表达调控的机制也更具多样性和复杂性,表征LncRNA在肿瘤中的功能机制不但有助于生物分子临床标记的应用,也可促进新的癌症治疗靶点的开发。在前期生物信息学分析工作中发现,位于染色体13q12.3上的长非编码RNA LINC00365在胃癌患者癌与癌旁及正常组织中存在明显的表达差异,通过表达性相关分析,SCGB2A1(乳房珠蛋白B)与LINC00365存在表达正相关。生物学实验验证在胃癌细胞中LINC00365可通过调控SCGB2A1进而影响肿瘤生物学特性。NF-κB自1986年作为细胞快速反应诱导转录因子被发现至今,因广泛参与调控免疫、炎症、癌症等过程发挥关键作用,一直是药物学靶向研究的热点。核转录因子NF-κB激活后参与多种基因的转录调控,细胞凋亡相关蛋白、趋化因子、转化生长因子等促进肿瘤细胞的增殖及凋亡逃逸。已有多个研究证明NF-κB在乳腺癌中呈过度活化趋势,可作为乳腺癌治疗重要分子靶标。基于综述已有文献报道和前期研究推测,LINC00365-SCGB2A1通路是否可能通过影响NF-κB转录活性影响乳腺癌细胞增殖与凋亡。本研究基于临床乳腺癌患者组织标本及乳腺癌细胞系,首先验证LINC00365与SCGB2A1表达的相关性及两者间的调控关系,然后基于细胞实验表征LINC00365在乳腺癌细胞中的生物学功能,以探讨LINC00365-SCGB2A1信号通路在乳腺癌发展过程中的作用以及具体机制。实验方法:1.实时定量PCR法检测30例乳腺癌患者组织标本(癌组织与癌旁组织相匹配)、正常乳腺MCF-10A细胞、乳腺癌MCF-7、T47D细胞中LINC00365与SCGB2A1的转录水平。2.构建并转染LINC00365过表达载体,在MCF-7、T47D细胞中过表达LINC00365后,qPCR及Western Blot法检测SCGB2A1的转录水平及蛋白表达。3.构建并转染SCGB2A1过表达载体,在MCF-7、T47D细胞中过表达SCGB2A1后,qPCR检测LINC00365的转录水平。4.将实验分为六组:(1)MCF-7_NC组:转染空载体到MCF-7细胞中(2)MCF-7_LINC00365组:转染LINC00365过表达载体到MCF-7细胞中(3)MCF-7_SCGB2A1组:转染SCGB2A1过表达载体到MCF-7细胞中(4)T47D_NC组:转染空载体到T47D细胞中(5)T47D_LINC00365组:转染LINC00365过表达载体到T47D细胞中(6)T47D_SCGB2A1组:转染SCGB2A1过表达载体到T47D细胞中5.细胞增殖与凋亡检测:RTCA实时监测细胞存活状态,EdU细胞增殖与克隆形成检测细胞增殖能力。流式细胞术检测细胞凋亡率,Western Blot检测Bcl-2家族蛋白与cleaved-Caspase3蛋白表达。6.NF-κB活性检测:双荧光素酶报告基因检测NF-κB的转录活性,Western Blot检测p-κBα与IκBα的蛋白表达,间接免疫荧光检测细胞核内p50蛋白表达;qPCR检测细胞中NF-κB下游靶基因CXCL-8、TGF-β、c-IAP1的转录水平。实验结果:1.与癌旁组织相比,乳腺癌组织中LINC00365与SCGB2A1转录水平均呈低表达,皮尔森分析结果表明组织中二者转录水平呈正相关(r=0.682);与乳腺正常MCF-10A细胞相比,乳腺癌MCF-7、T47D细胞中 LINC00365 SCGB2A1转录水平表达降低。2.转染LINC00365过表达载体后,MCF-7和T47D细胞中,LINC00365转录水平增高,SCGB2A1转录水平以及蛋白表达增高。3.转染SCGB2A1过表达载体后,MCF-7和T47D细胞中,SCGB2A1转录水平表达增高,LINC00365转录水平未见明显变化。4.与MCF-7_NC组相比,MCF-7_LINC00365组、MCF-7_SCGB2A1组细胞存活率下降,增殖能力降低;与T47D_NC组相比,T47D_LINC00365组、T47D_SCGB2A1组细胞存活率下降,增殖能力降低。5.与MCF-7_NC相比,MCF-7_LINC00365组、MCF-7_SCGB2A1组细胞凋亡率增高,cleaved-Caspase3蛋白表达增高,Bax/Bcl-2比值增高;与T47D_NC组相比,T47D_LINC00365组、T47D_SCGB2A1组细胞凋亡率增高,cleaved-Caspase3蛋白表达增高,Bax/Bcl-2比值增高。6.与MCF-7_NC组相比,MCF-7_LINC00365组、MCF-7_SCGB2A1组细胞内NF-κB转录活性降低,p-IKBα蛋白表达降低,IκBα蛋白表达增高,细胞核内p50蛋白表达降低,CXCL-8、TGF-β与c-IAP1转录水平降低;与T47D_NC组相比,T47D_LINC00365组、T47D_SCGB2A1组细胞NF-κB转录活性降低,p-IκBα蛋白表达降低,IκBα蛋白表达增高,细胞核内p50蛋白表达降低,CXCL-8、TGF-β与c-IAP1转录水平表达降低。结论:1.与癌旁组织及正常乳腺细胞相比,乳腺癌组织与乳腺癌细胞中LINC00365与SCGB2A1转录水平均呈低表达,且LINC00365正向调控SCGB2A1转录水平及蛋白表达。2.LINC00365-SCGB2A1信号通路可通过调控NF-κB的活化抑制乳腺癌细胞增殖并促进细胞凋亡。