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第一部分黄芩素对胶原诱导型关节炎小鼠的治疗作用目的:初步观察黄芩素(Baicalein,BAI)对胶原诱导型关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠的保护作用并探究可能机制。方法:(1)使用牛二型胶原诱导DBA/1小鼠,建立CIA小鼠模型。(2)二次免疫后分组为CON组(未造模组)、CIA组(CIA造模组)、DMSO组(CIA造模+溶剂组)、BAI组(CIA造模+BAI给药组);BAI组隔日腹腔注射BAI;DMSO组给予腹腔注射等量的DMSO。(3)二次免疫后一周开始观察各组小鼠四肢关节,隔日记录关节炎评分。(4)记录3周关节炎评分后,于CIA组关节炎评分到达最高水平时,对各组小鼠踝关节进行X线检测。(5)脱颈处死小鼠前,取各组外周血,使用ELISA法检测各组血清中TNF-α,IL-1β、IL6的表达量。(6)取下各组踝关节,使用4%多聚甲醛固定,脱钙后石蜡切片,H&E染色观察各组踝关节病变程度。结果:(1)二次免疫后,成功建立了CIA小鼠模型。(2)关节炎评分结果:BAI组关节炎评分低于CIA组和DMSO组。(3)ELISA结果:各组外周血中TNF-α量为,CON组(326.1±49.68 pg/ml)、CIA组(525.8±21.68 pg/ml)、DMSO组(448.1±37.08pg/ml)、BAI组(299.9±72.02 pg/ml);IL-1β量为,CON组(46.68±3.058pg/ml)、CIA组(127.3±1.1pg/ml)、DMSO组(74.12±1.9pg/ml)、BAI组(48.37±0.9334 pg/ml);IL-6量为,CON组(78.13±4.26pg/ml)、CIA组(194±1.58pg/ml)、DMSO组(117.4±2.84pg/ml)、BAI组(82.03±2.754 pg/ml);可见三种炎症因子相比于CON组,CIA组显著上调,DMSO组略有下降,BAI组显著下降。(4)X线结果:相比于CON组和BAI组,CIA组和DMSO组小鼠踝关节X线可以看出明显软组织肿胀和跗骨关节破坏。(5)H&E染色结果:相比于CON组,其余三组踝关节中可见软骨下骨内脂肪组织被炎症细胞浸润所代替,CIA组、DMSO组和BAI组可见明显滑膜增生,BAI组增生程度低于CIA组和DMSO组。结论:(1)BAI对CIA小鼠有保护作用,可减轻踝关节的肿胀和滑膜增生,并延缓骨质破坏的进展。(2)BAI可以降低CIA小鼠外周血中TNF-α、IL-1β、IL6表达量。第二部分黄芩素对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞样细胞增殖、凋亡的影响及可能机制目的:(1)检测CIA病变踝关节中软组织增殖情况以及可能机制;(2)观察黄芩素对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者滑膜成纤维细胞样细胞(Fibroblastlike synoviocytes,FLS)增殖的影响。(3)观察BAI对RA FLS凋亡的影响并探讨凋亡的可能机制。方法:(1)使用WB方法检测第一部分中各组小鼠踝关节周围软组织中PCNA、AKT、P-AKT的表达量。(2)体外分离提取RA患者的FLS,使用CCK8检测不同浓度BAI(5μM、10μM、20μM、40μM、80μM)对FLS增殖的影响。(3)使用Annexin V试剂盒染色后,使用流式细胞仪检测不同浓度BAI(20μM、40μM、80μM、160μM、320μM)对FLS凋亡的影响。(4)使用160μM浓度的BAI培养RA FLS细胞,Tunel染色探究BAI对FLS凋亡的影响,WB检测AIF、BCL-2、BAX、Caspase3、active Caspase3蛋白的表达量。结果:(1)动物模型踝关节软组织WB实验发现相比于CON组,CIA组、DMSO组和BAI组中PCNA表达量升高,BAI组PCNA表达量低于CIA和DMSO组。重复三次实验,灰度分析发现差异具有统计学意义。4组AKT无明显变化,而PAKT的趋势与PCNA趋势一致,且差异具有统计学意义。(2)成功培养了6名RA患者的FLS。(3)CCK8结果:CON组和DMSO组的OD值无明显差异。在使用BAI后OD值开始降低,随着浓度升高,OD值减低的更为明显。(4)Annexin V流式检测凋亡发现使用含160μM和320μM BAI的培养基培养48h后凋亡显著增加,相比于DMSO组(2.98%),160μM组(12.23%)和320μM组(36.8%)凋亡率显著上升。(5)WB实验发现,相比于DMSO组,BAI组(160μM)中BCL-2下降,active Caspase3显著增高。结论:(1)BAI可以抑制RA FLS增殖,抑制效果随着浓度升高而增高。在体内也有抑制增殖的能力。(2)BAI在较高浓度时可以诱导RA FLS的凋亡。(3)BAI主要是通过降低BCL-2的表达,导致active caspase3的表达增多,最终引起细胞凋亡。第三部分黄芩素抑制TLR4受体通路在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞样细胞炎症表达的作用和机制目的:(1)观察BAI对RA FLS中TLR4激活导致炎症表达的作用和机制。(2)观察BAI在体内对于TLR4、TRAF6和P65的作用。方法:(1)使用不同浓度、不同时间的LPS刺激RA FLS细胞,PCR检测IL-6的变化,挑选合适的浓度和时间点。(2)使用不同浓度的BAI作用于FLS后,加入LPS,使用PCR检测IL-6的变化。(3)使用P65、P38、ERK、JNK的抑制剂处理细胞,并使用LPS刺激,PCR检测IL-6的变化。(4)在不同的时间点用LPS刺激RA FLS细胞,WB检测P65、P38以及其磷酸化的表达。(5)使用BAI处理细胞后,加入LPS刺激细胞,WB检测TLR4、My D88、TRAF6、P65、P-P65、P38、P-P38、ERK、P-ERK、JNK、P-JNK的表达。(6)使用WB的方法检测第一部分小鼠踝关节软组织中TLR4蛋白的表达,并检测其中My D88、TRAF6、P65、P38、P-P38的表达量。结果:(1)LPS可以显著上调RA FLS细胞中IL-6的表达,使用1μg/m L刺激12小时效果最为明显。(2)BAI可以抑制LPS诱导的IL-6的表达。(3)P65、P38、ERK抑制后IL-6表达降低,JNK抑制剂对LPS诱导的IL-6无明显抑制作用。(4)LPS加入后P65和P38的磷酸化显著升高,并在3小时内迅速降低,在30分钟时P-P65和P-P38的表达最高。(5)BAI可以特异性抑制P-P65的表达,随着浓度升高抑制效果越明显。同时BAI可以抑制TLR4和TRAF6的表达。(6)BAI在体内抑制了TLR4受体的表达,并抑制了TRAF6、P-P65的表达。结论:(1)LPS可以显著抑制LPS诱导的IL-6 mRNA表达。(2)BAI可以通过抑制TLR4-TRAF6-NF-kB通路降低LPS诱导的RA FLS炎症表达。(3)BAI在体内可以降低TLR4和TRAF6表达,抑制下游P65的磷酸化,从而起着抗炎的作用。