第一部分极早产儿主要临床问题回顾性分析目的：极早产儿(very preterm infants, VPT,胎龄<32wk)由于其解剖生理特点,易发生各种并发症,病死率及后遗症的发生率较高,对极早产儿周密的全面管理,是新生儿监护病房(NICU)中体现水平的综合反映。国内在极早产儿NICU救治、预后等方面研究资料匮乏。本研究通过回顾性分析超大容量NICU极早产儿临床病例资料,旨在了解：(1)极早产儿围生期特征、NICU中主要疾病构成、治疗手段及疾病负担；(2)极早产儿存活率、主要并发症患病比例以及预后的高危因素；(3)新生儿转运以及超大容量NICU对极早产儿临床转归的影响；(4)国内极早产儿救治现状与发达国家救治情况比较。希望通过此文研究为当前极早产儿救治难点、重点提供可靠的临床研究资料,为更大规模的极早产儿流行病学研究提供重要的理论依据。方法：回顾性收集2010年10月1日至2011年09月30日连续12个月内,八一儿童医院极早产NICU中收治的极早产儿病例资料。病例纳入标准：出生胎龄(GA)小于32wk、生后24小时内入住极早产NICU者。用SPSS软件进行统计分析。计量资料中连续变量呈正态分布者表示为均数±标准差,组间均数比较采用t检验或单因素方差分析；偏态分布者表示为中位数(范围或四分位数间距),组间均数比较采用秩和检验。计数资料以发生率或构成比表示,并对发生率作区间估计,发生率或构成比的比较采用卡方检验。因本研究为回顾性分析,结合研究人群特点,采用单因素Logistic回归模型对极早产儿死亡高危因素分析,进一步运用多因素Logistic回归模型进行多因素逐步回归分析以明确死亡的独立风险因素。变量间相关性采用Spearman等级相关分析。结果：1.人口学特征本次研究共收集病例1262份,符合入选标准的病例729例。其中164例为超早产儿(胎龄,GA≤28wk),占总数的22.5%；478例为极低出生体重儿(VLBW<1500g),占总数的65.6%；68例为超低出生体重儿(ELBW<1000g),占总数的9.3%。平均GA为29.8±1.4(范围23.9-31.9)wk。平均出生体重(BW)为1399±285(范围610-2415)g。男婴430例,占总的例数的59.0%。76例(10.4%)为小于胎龄儿(SGA),199例(27.3%)为多胎。平均入NICU时龄为2.2±2.3(范围0.3-24)小时。2.围产期特征544例(74.6%)极早产儿接受了规律产前检查,141例(19.3%)产前检查大于1次或情况不详。199例(27.3%)应用产前激素,362例(49.7%)剖宫产。153例(21.0%)胎膜早破>24h,64例(8.8%)产前抗生素治疗。461例(63.3%)的极早产儿母亲存在明确妊娠期疾病,包括妊娠高血压疾病160例(21.9%)、胎膜早破245例(33.6%)、前置胎盘或胎盘早剥72例(9.9%)、糖尿病72例(9.9%)等。213例(29.2%)极早产儿中有的产房用氧复苏史,其中103例(14.1%)极早产儿接受过氧气或气囊加压给氧,110例(15.1%)极早产儿在产房接受了气管插管,25例(3.4%)极早产儿接受了产房心脏按压,14例(1.9%)极早产儿产房复苏药物。3.极早产儿NICU主要疾病构成极早产儿主要疾病构成与GA、BW成密切相关,胎龄、BW越小,患病比例越高。呼吸系统疾病是极早产儿最常见诊断疾病,主要包括：499例(68.4%)呼吸窘迫综合症(RDS),353例(48.4%)新生儿肺炎,61例(8.4%)肺出血,55例(7.5%)新生儿持续性肺动脉高压(PPHN),22例(3.0%,,n=606例)支气管肺发育不良(BPD),16例(2.2%)气胸等。其他常见疾病主要有动脉导管未闭(PDA)462例(63.4%),呼吸暂停287例(39.4%),败血症92例(12.6%),脑室内出血(IVH)157例(21.5%),脑室周围白质软化(PVL)11例(1.5%),坏死性小肠结肠炎(NEC)22例(3.0%),3期以上早产儿视网膜病(ROP)11例(1.7%)等。4.呼吸系统疾病特征及临床治疗特点499例RDS极早产儿中,447例(89.6%)接受了肺表面活性物质(PS)治疗,66例(13.2%)接受了超过1次的PS治疗。应用PS与未使用PS相比,存活率无差异,但PS患儿GA较低、并发症比例较高、MV和氧疗时间较长；产房使用PS与NICU使用PS相比,两者GA、存活率、并发症、MV和氧疗时间等均无显著差异(P>0.05)；与牛源性PS相比,猪源性PS患儿GA、BW更低,住院时间更长,存活率较低但无显著差异(x2=2.625,P=0.105),主要并发症、MV和氧疗时间等均无显著差异(P>0.05)。RDS患儿499例(100%)接受机械通气(MV),其中79例(15.8%)只接受nCPAP,357例(71.5%)接受常频机械通气(CMV,不含HFOV),63例(12.6%)接受HFOV。三种通气方式中,HFOV存活率最低,MV时间最长,相关疾病或并发症比例最高(肺出血、气胸、重度IVH)；与仅nCPAP相比,CMV除肺出血比例较高外,存活率或主要并发症无差异。358例新生儿肺炎患儿中,57例(16.1%)痰培养阳性,其中培养阳性率较高的有：28例(49.1%)鲍曼不动杆菌,18例(31.6%)肺炎克雷伯菌,6例(10.5%)大肠埃希菌和3例(7.0%)铜绿假单胞菌。55例PPHN患儿中HFOV的比例为24例(43.6%),吸入NO治疗的比例为44例(80.0%)。PPHN与PDA密切相关,接受PDA结扎术患儿中患有PPHN的比例显著高于非PPHN患儿(16.4%vs1.9%,P<0.001)。48例吸入NO的患儿中,8例(16.7%)需要接受PDA结扎术,占所有PDA结扎术患儿(22例)的36.4%。606例极早产儿纠正胎龄36wk治愈或好转出院无氧依赖,22例(3.6%)纠正胎龄36wk仍需氧疗诊断为BPD。其中7例(31.8%)在生后28天接受激素治疗,3例(13.6%)出科时需吸氧,19例(86.4%)治愈出院。5.其他常见疾病特征及临床治疗特点极早产儿入住NICU后根据病情需要至少进行1次床旁头颅超声。157例(21.5%)IVH是超声诊断比例最高的疾病,GA越小、BW越低,IVH比例越高。IVH在超早产儿比例为42.1%,VLBW比例为24.3%。92例败血症极早产儿中,血培养阳性70例(76.1%)。其中,肺炎克雷伯菌培养阳性率最高37.1%(26例),其次为葡萄球菌30.0%(21例)、真菌12.9%(9例)、大肠埃希菌7.1%(5例)、鲍曼不动杆菌5.7%(4例)等。22例NEC患儿中,只有7例(31.8%)接受手术治疗,病死率为36.4%(8例)。死亡患儿中3例(37.5%)接受了手术治疗,5例(62.5%)选择了放弃治疗。638例极早产儿在出院或死亡之前至少接受了1次眼底筛查,106例(16.6%)极早产儿有不同程度ROP表现,其中127例受检超早产儿、410例受检VLBW患儿的检出比例分别为47.2%(60例)、23.4%(96例)。ROP患儿中11例(10.4%)接受了激光光凝手术治疗。与未检出ROP的存活极早产儿比较,ROP患儿的吸氧时间显著延长(中位数：26天vs7天,P<0.001)；与未接受手术治疗的ROP超早产儿相比,接受ROP光凝术的超早产儿氧疗时间显著较长(中位数：44天vs29天,P<0.001)。极早产儿PDA比例按胎龄分层有显著差异,GA越小,患病比例越高。462例PDA患儿中,380例(82.3%)接受了布洛芬治疗,其中130例(34.2%)患儿接受布洛芬治疗超过1个疗程,GA越小,接受布洛芬治疗疗程越多。365例接受心脏超声复查,205例(56.2%)患儿首个疗程后PDA闭合,83例(22.7%)的患儿需接受多个疗程后PDA闭合；GA越小,PDA闭合的比例越低。22例(4.8%)PDA患儿在接受布洛芬治疗后选择PDA结扎术；GA越小,PDA结扎术的比例越高。82例(17.7%)PDA未接受布洛芬治疗,心脏超声复查PDA自发性闭合的比例较布洛芬治疗的比例高(90.2%vs78.9%,P<0.05),但布洛芬治疗者GA和BW均较低、合并肺出血的比例较高、接受MV、氧疗和住院时间较长以及住院费用较高,存活率无差异。接受多疗程布洛芬治疗的PDA患儿,GA较低,合并PPHN及吸入NO治疗的比例、PDA结扎术的比例均较高,接受MV、氧疗和住院时间较长以及住院费用较高,但存活率与1个疗程布洛芬PDA患儿相比无差异(92.8%vs94.6%,P=0.495)。6.极早产儿转运特点以及对极早产儿临床转归的影响入选研究对象中,73例(10%)为本院出生新生儿(inborn),656例(90%)为转运新生儿(outborn)。转运新生儿入院时龄为2.0小时(中位数),本院出生新生儿为0.5小时(中位数),两者有显著性差异；GA、BW无差异(P>0.05)。本院出生新生儿剖宫产、胎膜早破>24小时比例高于转运新生儿,而后者多胎比例高于前者(x2=4.173,P=0.041)。转运新生儿产房抢救措施比例较本院出生新生儿高,但无显著统计学差异(x2=3.588,P=0.058)。573例(78.6%)极早产儿入NICU前转运中接受氧疗。转运中氧疗模式主要为面罩319例(55.7%)和气管插管气囊加压人工呼吸240例(41.9%)；氧疗的比例与GA、BW密切相关,胎龄越小、BW越低,接受氧疗比例越高(x2=124.7,P<0.001)。对极早产儿入院后呼吸系统主要疾病、治疗措施以及IVH比例比较,转运新生儿和本院出生新生儿无差异(P>0.05)。治愈或好转出院患儿中转运新生儿与本院出生新生儿的存活率无差异(91.3%vs94.5%,P=0.384),主要并发症比例、MV、氧疗和住院时间、住院费用均无统计学差异(P>0.05)。对入院极早产儿按入院时龄2小时(中位数)分层比较,入院时龄≤2h组GA、 BW均无显著统计学差异。入院时龄<2h患儿母亲体外人工受精妊娠、妊娠高血压疾病、规律产检、产前激素治疗和选择剖宫产比例显著高于入院时龄>2h组,而后者生后窒息、产房有创性复苏措施比例较高。入院时龄≤2h组患儿存活率高于入院时龄>2h组(91.2%vs84.8%,P<0.05),且放弃治疗存活出院的比例显著低于后者(11.2%vs21.7%,P<0.01)；存活者中主要并发症比例、MV、氧疗时间和住院时间以及住院费用等均无统计学差异(P>0.05)。7.死亡、存活者主要并发症高危因素分析极早产儿NICU病死率为8.4%(61例),包括13例(1.8%)院内死亡和48例(6.6%)放弃治疗死亡。其中病死率超早产儿为21.3%(35例),VLBW为10.5%(50例),ELBW患儿为26.5%(18例)。GA、BW越低,病死率越高。57例(93.4%)患儿死于新生儿期。多因素logistic回归分析表明低GA、有创MV、入院时龄>2h、合并气胸、合并肺出血、未使用PS治疗、严重先天畸形是极早产儿死亡的独立高危因素。8.存活极早产儿住院时间和疾病负担存活极早产儿住院时间为43天(中位数),住院费用为46409元(中位数),住院费用大约为同期北京市城市居民年收入的1.4倍。GA越小,住院时间越长、疾病负担越重。例如,住院时间(中位数)、住院费用(中位数)GA<26wk分别为92天、132771元,GA31wk分别为37天、38142元。9.放弃或姑息治疗131例(18.0%)极早产儿家长放弃或姑息治疗,其中67例(51.1%)是由于不能支付继续住院治疗费用,31例(23.7%)与患儿治疗效果差有关,21例(16.0%)是由于伴有严重并发症,12例(9.2%)是由于严重先天性疾病。患儿放弃治疗后死于医院的比例为36.6%(48例)。10.极早产儿临床特征与发达国家比较本研究中极早产儿产科干预比例与发达国家相比明显较低,新生儿转运比例明显高于发达国家,后者以产前转运为主。极早产儿总体存活率与发达国家水平相当,但主要并发症比例较发达国家低,分析可能与本院超早产儿的比例低、存活率较低有关。结论：1、本研究首次回顾性全面分析了国内超大容量NICU极早产儿病例资料,开创性的总结了国内首个NICU亚专科监护病房极早产儿的救治经验。研究结果表明极早产儿的救治水平,如89.5%的VLBW患儿治愈或好转出院,与美国等发达国家同期NICU中VLBW患儿存活率90%相当。2、本研究中极早产儿产科主动干预比例(如产前激素应用、剖腹产比例)明显低于发达国家水平,而后者大量文献研究表明极早产儿产前激素应用可以显著降低极早产儿的病死率和并发症比例,因此我们可能在一定程度上延缓了极早产儿抢救时机,影响了极早产儿,特别是超早产儿在NICU中的转归。如我院超早产儿存活率为78.7%,与美国(88%)等发达国家同期水平相比,仍然存在一定的差距。3、本院已成功建立了目前国内最大的极早产儿转运中心,所收治极早产儿中,90%通过本院新生儿转运系统由分娩医院主动转入。众所周知,极早产儿转运可能增加死亡和颅内出血等并发症风险,但本研究结果表明转运新生儿和本院出生新生儿的存活率、主要并发症比例无显著差异,提示通过完善的转运网络,短距离、2小时内新生儿转运以及区域性大规模的Ⅲ级NICU救治可以将转运相关的不良事件降至最低。4、极早产儿,特别是超早产儿的预后差风险高、疾病负担重,患儿家长救治意识(担心预后)以及社会、家庭经济水平严重影响这些患儿的预后。第二部分人脐带血间充质干细胞制备研究目的：间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是干细胞家族的重要成员,具有高度增殖、自我更新能力,广泛分布于骨髓、脐带血、脐带、胎盘等各种组织中。由于脐带血来源丰富,采集方便,排斥小,无伦理争议等优点,脐带血来源MSCs作为新生儿严重疾病移植用种子细胞受到重视。然而,脐带血(Umbilical Cord Blood, UCB) MSCs分离培养成功率低,目前对于如何从脐带血中获取MSCs仍存在争议。本研究的目的：(1)研究UCB-MSCs其体外分离、纯化及培养条件,并对其进行生物学特性进行鉴定,建立了稳定的UCB-MSCs培养体系。(2)明确不同GA来源UCB-MSCs培养成功率是否有差异。方法：(1)无菌条件下收集新鲜健康新生儿UCB,采用密度梯度离心法结合直接贴壁法体外分离UCB-MSCs,加入含体积分数为10%人胎牛血清的DMEM/F12培养基,调整细胞密度为1×1011/L接种于胎牛血清包被过的塑料培养瓶中,置于37℃、体积分数为5%的C02饱和湿度环境下培养。当培养瓶中的细胞生长到80%融合时,胰酶-EDTA混合液消化传代。观察贴壁细胞的形态学特征,计算累积群体倍增水平,应用流式细胞技术分析细胞增殖活性、免疫表型,特异性染色方法鉴定细胞的多向分化潜能。(2)将UCB依GA分为3组：足月儿组(GA>36周；n=16)；早产儿组(GA32-36周；n=11)；极早产儿组(GA<32周；n=9)。采取相对适应的条件培养,观察能成功培养出MSCs的比率,探讨GA、UCB采集量、UCB单核细胞(monocuclear cells,MNCs)数量对MSCs培养成功率的影响。结果：(1)UCB-单核细胞分离接种4-5d后开始可见有少量细胞贴壁,后贴壁细胞逐渐增多,并出现少量梭形和多角形细胞,2周后可见细胞形成集落,培养4-5周呈现融合。第2代细胞接种后24h内开始贴壁,2周左右即可达80%～90%融合。流式细胞仪细胞表面分子标记检测,此类细胞稳定地表达相关MSCs抗原标记CD105、CD90、CD73和HLA-ABC,但不表达造血干细胞标志物CD14、CD34和CD45。经特殊培养基诱导细胞分化实验证实成功向软骨、脂肪分化。传代15代以内细胞数扩增能力逐渐降低,第3代至第7代扩增能力较明显。流式细胞仪细胞周期及细胞凋亡检测表明细胞增殖力和生长均良好。细胞反复冻存复苏后细胞生物特性稳定。(2)GA、UCB采集量、MNCs数量对UCB-MSCs培养成功与否的有显著影响：①UCB-MSCs培养成功率为52.8%,成功者GA明显小于未成功者(34.0±4.2vs36.8±3.3wk;t=2.184,P=0.036),MSCs培养成功率随GA增加呈降低趋势,差异无显著统计学意义(x2=3.769,P=0.152)。②成功者采血量显著高于未成功者(43.2±13.6vs32.1±11.5ml;t=2.635,P=0.013)。成功者不同GA间UCB采血量有显著差异(F=4.003,P=0.039),GA越大,采血量越多。③成功培养MSCs的样本单位体积内MNCs数显著高于未培养出MSCs的样本(32.9±11.7vs23.7±6.5×106/ml；t=2.863,P=0.008)；成功者不同GA间UCB单位体积内MNCs数无显著差异(F=1.087,P=0.361)。④按GA分层对MSCs产率比较,结果发现三组间有显著性统计学差异(F=13.309,P=0.000):GA越小,MSCs产率越高。结论：(1)本实验通过对传统方法的优化,根据细胞生长形态、细胞表明标记分子以及体外分化实验结果表明我们成功分离UCB-MSCs,同时体外扩增可以获得丰量的UCB-MSCs,细胞经冻存后复苏培养、反复传代后检测细胞生物学特性稳定,表明我们已建立了稳定的UCB-MSCs培养体系。(2)UCB培养成功率仍较低,其中GA.UCB采集量、MNCs数量对UCB-MSCs培养成功与否的有显著影响。小胎龄、UCB采集量越多、单位体积内MNCs数量越多等可能是UCB-MSCs相对容易培养成功的原因。小胎龄UCB-MSCs产率高于大胎龄,提示小胎龄UCB可能是更佳的MSCs体外分离培养来源。