论文部分内容阅读
心血管疾病多年来一直位于全球居民疾病致死的首位。其中,脑卒中(Stroke)、冠心病(Coronary heart disease)、肺原性心脏病(Pulmonary heart disease)和心力衰竭(Heart failure,HF)等心血管疾病近几年来患病人数持续增加。而心脏肥大作为一项严重的心脏异常指标,如果不能及时得到控制,将会使得心脏的代偿功能失调,从而引发心力衰竭等一系列致死性心脏疾病。心脏肥大是由于受到外部因素或内源性因素带来的各种刺激的情况下心脏为了维持正常的心输出量,导致蛋白质合成增加和心肌细胞体积增大,而引起的心脏异常。而心肌细胞内外Ca2+浓度的改变与心脏肥大的发生有着密切关联,Ca2+调节机制发生障碍是心脏肥大发生的重要原因。CMDA、CMDB作为参与细胞膜上钙离子通道兰尼碱受体2(Ryanodinereceptor2,RyR2)通道调节的相关蛋白,对于心肌细胞的钙离子调节发挥着重要作用。目前的研究中,已知CMD作为磷蛋白磷酸酶PPT家族中的一种,可使T细胞核因子(Nuclear factor of activated Tcells,NFAT)活化而发生去磷酸化,然后将其转移到细胞核中与其他转录因子相结合激活下游目标,并且CMDA引发心脏肥大的事实也有被报道。研究发现,使用CMD抑制剂可抑制心脏肥大,但对于CMD引发心脏肥大的具体机制目前尚不明确。PPTA与CMD同为蛋白磷酸酶,该蛋白与心脏肥大的发生也有一定关联。另外,CAMRl/CAMR2属于FK506结合蛋白(FK506 binding protein,FKBP)家族亲免素,同时也是RYR2受体上的调节蛋白,可在调节心脏收缩-耦联的过程中发挥作用。但是,关于CMD调节心脏中钙离子浓度的分子机理,CMD的过表达与PPTA、CAMRs的相关性,以及CMDA、CMD B是否与CAMRs蛋白相互作用来调节RYR 2钙离子通道,这些都是目前科研工作者还没有揭开的谜题。本课题以HEK293、CHO两种细胞系为研究对象,探究过表达CMD A、CMD B基因对于细胞肥大及细胞中钙相关蛋白调节分子机制的影响。通过分子克隆构建重组质粒,将重组质粒转染进入HEK293、CHO两种细胞系中,进行荧光检测。通过高内涵细胞成像分析系统拍摄分析、计算转染后24 h、36 h、48 h、60 h、72 h细胞面积变化情况、同时借助荧光图像计算细胞体积变化情况,以此分析上述两种基因对心脏肥大的影响。提取转染后两种细胞的总蛋白,通过Western blot检测钙相关蛋白的表达。提取转染后HEK293细胞的总RNA通过实时荧光定量PCR检测在CMD A、CMD B基因调节下钙相关蛋白在mRNA水平的表达情况。利用细胞周期同步化和流式细胞术检测分析CMD A、CMDB基因对于HEK293细胞周期的调控。结果显示如下:1.体外HEK293和CHO细胞基因过表达模型构建:通过报告基因荧光蛋白的表达观测到对于CMDA和CMDB基因,HEK293、CHO两种细胞转染效率分别可达到50%和70%,基因表达情况较好,这是研究上述基因相关功能的重要前提。2.HEK293和CHO细胞体积和面积的变化:测量过表达CMD A、CMDB基因的HEK293、CHO细胞的体积和面积,显示HEK293体积相对于对照组呈现出增大趋势,其中过表达CMDA基因全序列的细胞体积显著增大;CHO细胞体积相较于对照均显著增大。CHO细胞面积在转染后24 h开始呈现增大趋势,转染后36 h～72h相对于对照组,面积呈现显著增大。也就是说过表达CMD基因可使细胞发生肥大。3.CMD A、CMDB基因调控钙相关蛋白的表达:在过表达CMD A、CMDB基因的HEK293细胞系中,CAMR1、CAMR2、PPTAB、PPTAC蛋白的表达均有增加,其中CAMR1、PPTAB、PPTAC表达量与对照组相比,上调趋势呈现极显著差异(P<0.05);同时在过表达CMD A、CMDB基因的CHO细胞系中,CAMR1、PPTAB的表达量也均显著上调(P<0.05)。4.CMDA CMDB基因调控钙相关蛋白基因在mRNA水平的表达:实时荧光定量PCR结果表明:在HEK293细胞系中,CMDA、CMD B可上调钙相关蛋白基因CAMR1、CAMR2、PPTAA、PPTAC在mRNA水平上的表达。并且其调控CAMR2、PPTAA、PPTAC在mRNA水平的表达的增加作用极为显著,对于CAMR1的表达只有上调趋势,与对照相比无显著性差异。5.细胞周期测定结果显示:HEK293细胞周期同步化效率较高,且过表达CMD A、CMD A基因全序列和CMD B的细胞中,细胞周期在G2/M期发生阻滞。结论:本文通过体外系统,成功构建过表达CMD A、CMD B基因的HEK293和CHO细胞变大模型,进而以CMDA、CMDB为靶点研究导致细胞体积变化的相关分子机理,从蛋白水平和mRNA水平上揭示了 CMD A、CMD B基因与细胞内钙相关蛋白的相关性。其中,钙相关蛋白CAMR1、CAMR2、PPTAB、PPTA C在蛋白水平均被CMD A、CMDB显著上调;CMD A和CMDB也使得CAMR2、PPTAA、PPTAC在mRNA水平的表达显著上调。此外,过表达CMD基因会使得细胞周期在G2/M期发生阻滞。该结果可为研发预防和治疗心脏肥大引起的心血管疾病的有效药物提供理论基础。