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抑郁症是一种严重影响人类心理功能和生活质量的疾病,其发病率逐年上升,已经逐渐成为全球性的健康难题。由于目前在临床运用的抗抑郁药物仍存在许多不足,开发新型抗抑郁药物一直以来都是研究的热点。木豆素(Cajaninstilbene acid,CSA)是存在于木豆[Cajanus cajan(Linn.)Millsp.]叶中的一种苗类化合物,具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、抗菌等药理作用。实验室前期研究表明,CSA具有显著的神经保护作用,能够通过抑制氧化应激和内质网应激介导的凋亡等途径保护神经元,具有潜在的抗抑郁活性。而目前还没有研究对CSA的抗抑郁效应进行考察和报道。因此,本文首次通过抑郁动物模型和行为学检测评价CSA的抗抑郁作用,并结合抑郁症的病理机制假说,从下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴、神经递质、色氨酸(tryptophan,TRP)代谢和突触可塑性这几个方面对CSA可能的作用机制进行初步探讨。以期发现一种可以有效防治抑郁症的候选化合物,从而进一步开发成为抗抑郁新药。具体研究内容如下:1.CSA对行为绝望模型小鼠的抗抑郁作用及CSA急性毒性研究。连续7天口服给予雄性BALB/c小鼠CSA后进行悬尾实验和强迫游泳实验。结果显示,CSA在30mg/kg剂量下可以显著缩短悬尾实验小鼠的不动时间;CSA在30、60mg/kg剂量下可以显著缩短小鼠强迫游泳不动时间。该结果提示CSA在一定剂量下具有抗抑郁作用。急性毒性实验显示,CSA 口服给药的半数致死量LD50为674.5 mg/kg,95%可信区间为572.8～798.2 mg/kg,属低毒。2.CSA 对慢性不可预测温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)模型小鼠的抗抑郁作用。对雄性BALB/c小鼠进行CUMS造模,通过体重、糖水偏爱实验、空场实验、新奇抑制摄食实验、悬尾实验和强迫游泳实验等行为学检测进一步探究CSA的抗抑郁作用。结果显示,CUMS应激引起了小鼠的抑郁样行为,包括糖水偏爱指数下降,新奇抑制摄食潜伏期延长,悬尾不动时间延长。CSA15、30 mg/kg可以显著升高模型小鼠的糖水偏爱指数,有效减少新奇抑制摄食潜伏期,CSA30mg/kg可显著减少CUMS小鼠悬尾不动时间并增加其做功数,提示CSA具有抗抑郁作用。而体重测试、空场实验表明CSA对于小鼠的体重和自主活动没有显著影响。与正常组相比,模型组动物的强迫游泳不动时间无明显延长,且给药后动物的不动时间也无明显改变。3.CSA对CUMS模型小鼠血清皮质酮水平的影响。采用酶联免疫吸附检测的方法测定动物血清内皮质酮的含量。结果表明,CUMS造模引起了小鼠血清内皮质酮水平的显著升高,而给予CSA15mg/kg后可以显著减少CUMS小鼠血清皮质酮的水平,说明CSA可能通过抑制HPA轴功能而产生抗抑郁作用。4.CSA对CUMS模型小鼠脑内神经递质水平的影响。通过LC-MS/MS法检测小鼠皮层和海马组织中神经递质的含量。结果表明,与正常组比较,CUMS小鼠皮层中多巴胺(dopamine,DA)、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)、谷氨酸(glutamate,Glu)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)含量显著减少。CSA7.5mg/kg 可以显著提高CUMS小鼠皮层中NE、Glu和GABA的含量,CSA 15 mg/kg可以显著提高CUMS小鼠皮层中NE、Glu和DA的含量,而CSA 30 mg/kg可显著提高CUMS小鼠皮层中5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量。与正常组比较,CUMS小鼠海马中乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)含量显著减少且CSA7.5mg/kg、15mg/kg可以逆转这一趋势。综上说明,CSA可能通过调节脑内的神经递质水平进而产生抗抑郁活性。5.CSA对CUMS模型小鼠TRP代谢的影响。通过LC-MS/MS法检测小鼠皮层、海马和血清中TRP代谢物的水平,包括TRP、5-HT、犬尿氨酸(Kynurenine,KYN)、犬尿喹啉酸(Kynurenic acid,KYNA)、3-羟基犬尿氨酸(3-Hydroxykynurenine,3-HK)和 5-羟吲哚乙酸(5-Hydroxyindoleaceticacid,5-HIAA)。结果表明,与正常组相比,模型组皮层中TRP、KYNA含量显著减少。CSA7.5mg/kg和15mg/kg可显著提高皮层内KYNA含量,而CSA30mg/kg可显著提高皮层内5-HT含量。与正常组相比,模型组海马中KYN含量显著升高。但帕罗西汀、CSA均未显著改变CUMS小鼠海马内TRP及其代谢物的水平。与正常组相比,模型组小鼠血清中5-HT、KYNA含量显著减少,KYN含量显著增加。帕罗西汀、CSA7.5 mg/kg可显著降低模型小鼠血清中KYN含量,CSA 30 mg/kg可显著提高模型小鼠血清内KYNA的含量。说明CSA抗抑郁作用的产生可能与其能够调节TRP代谢有关。6.CSA对CUMS模型小鼠皮层内突触可塑性相关蛋白及通路的影响。采用Western Blot方法观察小鼠皮层内相关蛋白的表达情况。结果表明,CUMS应激能显著降低小鼠皮层内脑源性神经营养因子(Brainderivedneurophic factor,BDNF)、原肌球蛋白受体相关激酶B(Tropomyosin receptor-related kinase B,TrkB)和突触后致密蛋白-95(Postsynapticdensityprotein-95,PSD-95)的水平,并且抑制蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的磷酸化,而这些改变均可被CSA所逆转。说明CSA可能通过上调BDNF/TrkB和Akt/mTOR通路,促进CUMS小鼠皮层内突触后蛋白的合成来促进突触可塑性,并最终产生抗抑郁作用。7.基于脑微透析技术探究木豆素对大鼠内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex,mPFC)细胞间液神经递质和色氨酸代谢物水平的影响。采用正常雄性SD大鼠及CUMS雄性SD大鼠通过脑微透析技术动态收集CSA给药后6 h内清醒大鼠mPFC中的微透析样品,LC-MS/MS法检测其中神经递质和TRP代谢物的水平。结果表明CSA可以提高正常清醒大鼠mPFC细胞间液中NE、Glu和ACh的水平,降低KYN的水平。对于CUMS大鼠,CSA可以提高其mPFC细胞间液中KYNA的水平,并降低5-HIAA以及KYN的含量。说明CSA能够快速地调节mPFC细胞间液中的神经递质水平和TRP代谢。以上结果提示,CSA能有效改善甚至消除抑郁模型动物所表现出的抑郁样行为,并可能通过调节HPA轴、神经递质水平、TRP代谢及突触可塑性相关蛋白和通路产生抗抑郁作用。