1目的当前环境铜污染急剧加重。铜是人体内一种必需的微量元素,在人体的新陈代谢过程中发挥重要作用,但高浓度铜蓄积对机体的影响尚不清楚,尤其是对女性生殖和卵泡发育的影响仍缺乏系统研究。针对这一现状,本课题拟观察和研究铜中毒对人类生殖和卵泡发育的影响,并探索有效的中医药治疗对策。课题将调查人类天然的铜负荷模型——Wilson病患者中月经失调发生的情况;研究补肾化痰祛瘀方对Wilson病卵泡发育及月经后期的临床观察;并在动物模型初步探索铜负荷对卵泡发育的影响和补肾化痰祛瘀中药的作用机制。2方法2.1临床调查对2015年5月至2015年10月在安徽中医药大学第一附属医院脑病中心接受治疗的育龄期Wilson病女性患者的月经史(初潮年龄、月经周期、行经天数、月经量等)进行回顾性问卷调查。2.2临床研究随机选取2014年9月至2015年8月在安徽中医药大学第一附属医院脑病中心住院治疗的40例月经后期的Wilson病患者;随机分为治疗者和对照组,每组各20人。对照组采取常规的保肝排铜药物治疗,治疗组在以上常规治疗的基础上,加用补肾化痰祛瘀方治疗,共服用3个月经周期。观察优势卵泡的最大直径变化及所有患者的治疗前后月经情况的变化。2.3实验研究将60只ICR雌性小鼠随机分为3组:正常对照组、铜负荷模型组、补肾化痰祛瘀方组,每组20只。铜负荷模型组、补肾化痰祛瘀方组小鼠每日给予按铜浓度100mg/kg体重的铜溶液灌胃,灌胃体积:0.2ml药液/10g体重,正常对照组小鼠每日灌胃等体积的生理盐水,每日上午1次。在给铜的第15天,开始灌胃给药,按照体表面积换算法,将补肾化痰祛瘀方的每日成人剂量换算为小鼠的药物剂量给药,灌药量:0.2ml药液/10g体重,每日下午1次。正常对照组与铜负荷模型组分别灌胃等体积的生理盐水。至给铜第28天结束。he染色观察各组小鼠各级卵泡生长、闭锁情况;电镜观察小鼠卵巢超微结构变化;孤雌激活法观察小鼠卵母细胞发育潜能;免疫印迹法检测p-erk及erk蛋白水平。3结果3.1wilson病育龄期女性患者月经失调情况109例患者中,2例患者出现原发性闭经,5例患者出现继发性闭经。107例有月经史患者中,62人出现月经失调。3.2wilson病患者优势卵泡数目、大小的变化及疗效的变化治疗组和对照组在治疗后,直径>15mm的发育良好的卵泡数目明显多于治疗前,优势卵泡的直径明显大于治疗前(p<0.05)。治疗组在发育良好的卵泡数目和优势卵泡的大小方面均显著优于对照组(p<0.05或0.01)。治疗组的有效率明显高于对照组,两组比较,差异具有统计学意义(p<0.001)。3.3实验研究结果3.3.1铜负荷对小鼠卵泡形态学的影响及补肾化痰祛瘀方的作用与正常对照组比较,铜负荷模型组小鼠卵巢内正常次级卵泡和正常窦卵泡数目均显著减少(p<0.01),闭锁的次级卵泡和窦卵泡数目均显著增加(p<0.01)。与铜负荷模型组比较,补肾化痰祛瘀方组小鼠卵巢内正常次级卵泡和正常窦卵泡数目明显增多(p<0.05),闭锁的次级卵泡和窦卵泡数目明显减少(p<0.05)。3.3.2铜负荷对卵母细胞超微结构的影响及补肾化痰祛瘀方的作用与正常对照组比较,铜负荷模型组小鼠可见显著凋亡的颗粒细胞及异常变性的线粒体(p<0.01)。与铜负荷模型组比较,补肾化痰祛瘀方组小鼠明显增加正常线粒体的数目、减少闭异常变性的线粒体数目(p<0.05)。3.3.3铜负荷对小鼠卵母细胞发育潜能的影响及补肾化痰祛瘀方的作用与正常对照组比较,铜负荷模型组卵母细胞的囊胚形成率显著降低,差异具有显著的统计学意义(p<0.01)。与铜负荷模型组比较,补肾化痰祛瘀方组小鼠可以明显提高卵母细胞的囊胚形成率(p<0.05)。3.3.4铜负荷对小鼠卵母细胞erk1/2的抑制作用与补肾化痰祛瘀方的激活作用与正常对照组比较,铜负荷模型组erk1/2磷酸化蛋白相对表达量显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。与铜负荷模型组比较,补肾化痰祛瘀方组小鼠ERK1/2磷酸化蛋白相对表达量明显增加(P<0.05)。4结论4.1月经失调是育龄期Wilson病女性患者中普遍存在的问题,但Wilson病引起月经失调的机制尚不明确,还需要进一步研究;4.2补肾化痰祛瘀方能够明显促进Wilson病患者的卵泡发育,显著有效改善该患者月经后期的症状;4.3铜负荷可损害卵巢结构,干扰卵泡的发育及成熟,降低卵母细胞的发育潜能;4.4益肾化痰祛瘀方可改善铜负荷小鼠卵泡的发育及成熟,提高卵母细胞的发育潜能;4.5铜负荷可抑制小鼠卵母细胞ERK1/2的磷酸化、益肾化痰祛瘀方可促进铜负荷小鼠卵母细胞ERK1/2的磷酸化;4.6益肾化痰祛瘀方可能通过促进铜负荷小鼠卵母细胞ERK1/2磷酸化激活从而促进卵泡发育及成熟,提高卵母细胞的发育潜能。