地衣芽孢杆菌两种光源联合诱变与鸡羽毛粉和豆渣固态发酵研究

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由于抗生素等药物的过度使用导致动物源食品的不安全引起了全世界的高度关注。大量科学研究表明,富含多肽的发酵饲料对于提高动物的免疫力、改善动物营养有重要的价值,已经成为了解决饲料抗生素滥用问题重要的选择之一。目前已经有企业在利用家禽羽毛进行非禽类动物饲料多肽的制备。角蛋白酶是将动物羽毛蛋白转化成活性多肽的重要酶之一,地衣芽孢杆菌(B.licheniformis作为安全的菌种可在发酵中产生一定量的角蛋白酶,因此利用地衣芽孢杆菌PWD-1对动物羽毛进行固态发酵,可以制备出富含多肽的生物饲料。然而初始地衣芽孢杆菌菌株存在产酶量不高的问题,会影响家禽羽毛发酵的效率、产率和产品活性等关键指标的提升。为此,本研究首先通过两种光源诱变的方法对其进行诱变改造,获得一株高产角蛋白酶的地衣芽孢杆菌突变株;然后,利用诱变菌株对拌有豆渣的鸡羽毛粉进行固态发酵,制备高活性的生物饲料。(1)提高角蛋白酶发酵产量的B.licheniformis PWD-1多光源联合诱变研究。为了提高角蛋白酶的产量,利用紫辐照和激光辐照二者单独和联合对B.licheniformis PWD-1进行诱变。最终选择60 min激光处理-10 min紫外处理的联合诱变方法,辐射距离4 cm,致死率为94%。从176个分离物中筛选出58个突变体,研究其产蛋白和角蛋白酶的能力,发现Lu11突变体的角蛋白与酪蛋白(k:c)比值最高(1.43),发酵后角蛋白酶酶活提高了2.7倍。LU11产角蛋白酶(65k Da)经过纯化后收率40%、纯化1.7倍,而初始菌株角蛋白收率29%、纯化1.38倍。角蛋白酶活活性最高的发酵条件为:发酵温度55°C、p H8。LU11 Z值为15.78°C,而初始菌株Z值为19.72°C。酶催化分析结果显示,LU11突变菌株的最大反应速率Vmax和特征常数(Kcat/Km)分别为357.17 U/ml和33.11min-1m M-1,显著高于出发菌株(分别为102.04 U/m L和28.36 min-1m M-1)。总之,突变菌株LU11产角蛋白酶的性质要优于初始菌株产酶的性质,LU11突变菌株可以用于降解有价值的角蛋白应用于食品、饲料、医药和化妆品工业中。(2)提高角蛋白酶酶活和发酵产物抗氧化活性的LU11固态发酵条件优化研究。将筛选获得的LU11突变菌株应用于两种农业食品工业废料鸡羽和豆渣的固态发酵,生产高附加值的多肽。经过单因素和响应面优化试验,获得最佳的发酵条件为:豆渣:鸡羽的质量比为10:7、接种量为15%、固态发酵时间为90 h。在最优条件下,角蛋白酶酶活性和DPPH自由基清除活性分别为910.12 U/g和85.03%;多肽含量为185.99 mg/g,较初始菌株提高了5.05%。SEM和EDX分析用于测定固态发酵对野生型和突变菌株对发酵底物的影响。与空白对照相比,突变菌株LU11和初始菌株的结晶指数(%Cr I)分别提高了31.24%和18.26%。主成分分析(PCA)结果表明突变菌株PC评分为99.17%,表明优化得到的LU11固态发酵条件是有效的。以上结果和特性分析表明,突变菌株LU11优于初始菌株,可用于固态发酵鸡羽毛和豆渣混合底物生产多肽。(3)提高角蛋白酶酶活和多肽产量的低强度磁场辅助固态发酵研究。为了进一步提高多肽产量和发酵角蛋白酶酶活,在LU11突变菌株固态发酵的过程中施加低强度磁场。首先对低强度磁场辅助发酵进行了单因素逐级优化试验,获得的最优条件为:每隔24 h(24、48、72 h)1次,共处理3次,每次处理时长4h,处理强度(m I)120 Gs。最优条件下角蛋白酶酶活和多肽产量分别提高10.31%和13.77%。为了测定低强度磁场对主要底物角蛋白的作用,在固态发酵的过程中施加不同强度(40、80、120、160 Gs)的磁场处理,磁场处理后提取角蛋白并分析结构的变化。SEM结果显示,随着磁场强度的增加,角蛋白表面变得疏松多孔,同时在磁场强度为80、120、160 Gs处理条件下检测有Na元素,但在40 Gs和空白并未检测到。AFM分析结果也显示,随着磁场强度的增强,角蛋白聚集的结构损坏并生成针状的突起。在120 Gs条件下,角蛋白表面粗糙度(Rq)增加1.41%,然而α-和β-角蛋白表面粗糙度分别显示下降和上升的趋势,可能因此增加了抗氧化的活性。与空白对照相比,·OH,DPPH自由基清除率和铁离子螯合能力分别增加26.98%、14.60%和32.72%。(4)不同发酵策略下饲料质量组成分析。最后,测定了磁场辅助固态发酵鸡羽和豆渣最优复合底物与单独底物(“鸡羽”“豆渣”)饲料的质量以复合底物不接种的发酵作为空白对照(以“复合空白”表示)。磁场优化复合底物在接种和不接种LU11分别用“复合11”“复合空白”表示),而单纯用LU11发酵鸡羽和豆渣用鸡羽11和豆渣11表示。复合11发酵产物的总氨基酸含量为84.29%、复合空白为59.29%、鸡羽11为18.67%、豆渣11为49.72%。蛋氨酸作为用于饲料添加重要的一种氨基酸,在鸡羽和豆渣原料中的含量分别为0.49%和0.21%,而复合11发酵产物中含量为1.09%。另外一种含硫氨基酸(SCAA)半胱氨酸,在鸡羽和豆渣原料中的含量分别为8.43%和0.05%,磁场辅助LU11固态发酵两种底物后分别增加到9.25%和0.13%,而在复合空白和复合11中分别达到6.14%和7.04%。气质分析结果表明,氨基酸中有毒氮的存在可能有助于分解代谢恶臭挥发性分子。结果发现复合11挥发性的化合物种类较多,但含量比其他样品低。复合11样品共有9类挥发性化合物以及其他一些杂类化合物。复合空白和鸡羽11不含有醛基类的化合物,而在豆渣11中含有,除了醛基类,醇基类的化合物也不含有。综上结果,复合11,具有均衡的氨基酸种类及低含量的挥发性化合物,可以考虑作为优质的家畜饲料。
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