论文部分内容阅读
米象（Sitophilus oryzae），是世界经济最重要的贮藏害虫之一，隶属于鞘翅目象虫科，对粮食贮藏造成了严重的损害。米象的防治目前主要是磷化氢熏蒸，磷化氢熏蒸剂其具有杀虫毒力高、渗透作用强等特点。但是现在我国多个省、市的粮库害虫米象产生了磷化氢抗性，因此开发米象的生物技术防治及明确米象的磷化氢抗性机制就非常迫切。本文采用Solexa高通量测序技术，对米象的转录组数据进行了研究和分析，明确了抗性相关的基因片段序列，研究了磷化氢熏蒸后米象谷胱甘肽硫转移酶相关基因和抗性基因的表达变化以及高温刺激后米象热激蛋白家族相关基因的表达变化。本研究结果首次明确了米象的遗传基因信息，为进一步开展米象全基因组测序、明确米象抗性分子机制以及米象的生物防治建立了基础。运用Solexa高通量测序技术，米象转录组数据库共获得21,583,796条reads数据，共包含1,618,784,700个核苷酸序列信息，得到67,264个Contigs片段，经过拼接共获得29,093条Unigenes，经NCBI数据库BLAST比对，共有16,734（57.5%）与已知的蛋白质具有相似性。转录组中Unigenes的KEGG功能注释分析结果表明，参与泛素系统通路的相关基因是778条，占9.31%；与肽酶相关的基因是512条，占6.13%；与转录因子相关的基因是489条，占5.85%；最少的为参与万古霉素类抗生素的生物合成、聚酮糖单位合成、1,1,1-三氯-2,2-双（4-氯苯基）乙烷（DDT）的降解、芴降解这4种途径相关基因，都仅只有1条。对米象的一些功能基因家族进行分析，包括7个具有代表性的基因家族。编码谷胱甘肽硫转移酶（GST）家族基因的Unigene序列为16个，分别编码GST的Delta、Sigma、Theta、Epsilon和Zeta亚基。编码细胞色素P450家族基因的Unigene为105个，分别编码16个P450家族的成员。编码热激蛋白（HSP）、保幼激素结合蛋白（JHBP）、几丁质酶（CHI）、气味结合蛋白（OBP）和神经肽（Neuropeptide）的Unigene分别为33、24、18、23、34个。我们进一步从转录组数据中鉴定出一些米象抗性靶标相关的10个特异性基因序列，包括乙酰胆碱酯酶（AChE），氨基丁酸（GABA）受体蛋白，烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）-α3、α6、α9、α10亚型，电压门控钙通道蛋白β亚型和电压门控钠离子通道蛋白等。荧光定量PCR结果显示，磷化氢熏蒸后，米象的谷胱甘肽硫转移酶相关基因的表达量总体呈上升趋势，但是上升水平明显不同；抗性相关靶标基因的表达量总体呈现下降的趋势，下降的程度也和具体基因有关。高温刺激后，米象热激蛋白家族相关基因的表达水平也呈现上升趋势，其中Hsp90、Hsp60和Hsp70基因表达量显著上升，Hsp40、Hsp10和Hsp21基因的表达量变化不大。