论文部分内容阅读
湖羊是世界上唯一生产白色羔皮的绵羊品种,以生产呈水波状花纹的羔皮著称于世。但近年来,湖羊的选育偏向于肉用性状的提升,忽视了原有的羔皮性状,此外,无计划的杂交,使得越来越多的湖羊基因混杂,湖羊羔皮品质急剧下降,优质种质资源受到严重威胁。因此,研究湖羊羔皮花纹形成的分子机制对湖羊羔皮种质资源的保护和利用具有重要意义。羊毛的弯曲度是决定羔皮品质的关键之一。根据花纹宽度和羊毛的弯曲程度,湖羊羔皮分为小花、中花、大花、直毛四个类型,因此,解析羊毛弯曲的分子机制对揭示湖羊羔皮花纹形成的分子机理具有重要意义。骨形态发生蛋白7（Bone morphogenetic protein 7,BMP7）基因是湖羊不同花纹类型羔皮间的差异表达基因,其表达量与不同花纹类型毛囊指标（初级与次级毛囊数量、直径等）间具有显著关联性。ceRNA调控网络是研究基因功能与机制的热点,课题组前期已经预测并验证了BMP7与miR-148a、miR-10a的靶向关系,但circRNA的在绵羊毛囊中的研究还几乎没有,因此,从circRNA-miR-148a/10a-BMP7的ceRNA调控机制的角度研究湖羊羔皮花纹的形成非常必要。湖羊花纹的形成与羊毛弯曲密切相关,羊毛弯曲形成又受毛囊调控。文献报道,毛囊中毛乳头细胞的类型和数量与毛发弯曲紧密相关,“多个真皮毛乳头中心”（Multiple papillary centres,MPC）假说也解释了毛发弯曲的细胞学机制。因此,本研究将通过以BMP7为核心的ceRNA调控网络角度研究对湖羊毛乳头细胞的影响,为后续解析羊毛弯曲以及羔皮花纹形成的机理提供基础。主要研究结果如下:（1）BMP7基因对湖羊毛乳头细胞增殖及TGF-β1/Smad信号通路的影响。在湖羊毛乳头细胞中过表达和干扰BMP7基因,过表达组毛乳头细胞活力、细胞增殖显著高于对照组（P<0.05）,毛乳头细胞周期进展显著加快（P<0.05）,TGF-β1/Smad信号通路Smad3、Smad4、TGF-β1的表达量较对照组呈现极显著降低趋势（P<0.01）,Smad6表达量较对照组呈显著下降（P<0.05）;抑制组毛乳头细胞活力、细胞增殖显著低于对照组（P<0.05）,毛乳头细胞周期进展显著减缓（P<0.05）,TGF-β1/Smad信号通路Smad3、Smad4基因的表达在干扰组中极显著高于对照组（P<0.01）,Smad5和TGF-β1基因的表达在干扰组中显著高于对照组（P<0.05）,表明BMP7基因对湖羊毛乳头细胞增殖具有促进作用,且能影响TGF-β1/Smad信号通路关键基因的表达。此外,在293T细胞中验证了 CRISPR/Cas9敲除BMP7的靶位点,可用于后续动物模型敲除。（2）miR-148a与miR-10a靶向BMP7对湖羊毛乳头细胞增殖的影响。在湖羊毛乳头细胞中分别过表达和干扰miR-148a和miR-10a,miR-148a mimic和miR-10a mimic组毛乳头细胞活力、细胞增殖都显著或极显著低于对照组（P<0.05或P<0.01）;细胞增殖相关基因CDK2、PCNA、cyclind1的mRNA水平也显著或极显著低于对照组（P<0.05或P<0.01）,其蛋白水平趋势与mRNA水平一致;毛乳头细胞周期进展显著减缓（P<0.05）,BMP7mRNA表达水平显著或极显著低于对照组（P<0.05或P<0.01）,其蛋白水平趋势与mRNA水平一致;影响TGF-β1/Smad信号通路关键基因显著或极显著变化（P<0.05或P<0.01）。miR-148a inhibitor 和 miR-10a inhibitor 组毛乳头细胞活力、细胞增殖都显著高于对照组（P<0.05）;CDK2、PCNA、cyclind1的mRNA水平极显著高于对照组（P<0.01）,其蛋白水平趋势与mRNA水平一致;毛乳头细胞周期显著进展加快（P<0.05）;BMP7mRNA表达水平显著或极显著低高于对照组（P<0.05或P<0.01）,其蛋白水平趋势与mRNA水平一致;影响TGF-β1/Smad信号通路关键基因显著变化（P<0.05）。Rescue实验验证了外源性添加BMP7蛋白能够恢复miR-148a/miR-10a过表达导致的毛乳头细胞活力的下降以及细胞增殖和周期减缓的作用;外源性添加BMP7干扰载体能够恢复miR-148a/miR-10a抑制导致的毛乳头细胞活力的上升以及细胞增殖和周期加快的作用,表明miR-148a与miR-10a能够靶向BMP7影响湖羊毛乳头细胞的增殖。（3）湖羊羔皮不同花纹circRNAs的筛选。利用RNA-seq技术筛选湖羊羔皮小花和直毛间差异表达circRNAs,共鉴定出5,527个circRNAs,其中114个circRNAs在两组间有差异表达。富集分析显示,部分差异表达circRNAs的来源基因富集在TGF-β通路、Notch通路。利用miRanda软件研究发现,129个miRNA可能与114个差异表达circRNAs 结合,包括 miR-148a、miR-199a-3p、miR-200a、miR-10a、miR-let-7a、miR-143等。此外,对circRNAs的编码潜力进行了预测,同时发现了 11个具有编码潜力的circRNAs。这些结果将为毛囊生长发育中circRNA竞争性miR-148a和miR-10a调节BMP7表达的分子机制提供依据。（4）circFTO与circCSPP1竞争性结合miR-148a/10a调节BMP7影响湖羊毛乳头细胞增殖。通过RNase R酶消化以及反向引物扩增的方法成功鉴定了 circFTO和circCSPP1的真实性,核质定位确定了 circFTO与circCSPP1主要分布在细胞质。双荧光素酶基因报告系统验证了 circFTO和circCSPP1分别与miR-148和miR-10a的靶向关系。通过Rescue实验验证了外源添加circFTO和circCSPP1能够恢复miR-148a/miR-10a过表达导致的毛乳头细胞活力的下降以及细胞增殖和周期减缓的作用,表明circFTO和circCSPP1能够分别竞争性结合miR-148a和miR-10a调节BMP7表达影响湖羊毛乳头细胞增殖的作用。