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目的:心血管疾病一直以来都是人类健康的主要威胁之一,其中血管内皮损伤是心血管疾病的首发事件,而氧化应激相关的内皮损伤是心血管疾病的起始因素。Bcl2相关的抗凋亡基因3（BAG3）是BAG家族的分子伴侣调节剂,它与各种蛋白质相互作用并通过激活多种途径影响细胞存活。BAG3与多种蛋白质相互作用,通过激活多种途径影响细胞存活,在细胞凋亡、细胞粘附、细胞骨架重塑和自噬中也发挥重要作用。先前的证据表明,BAG3参与调节心室肌细胞的收缩力和钙稳态。然而,BAG3在氧化应激相关内皮损伤中的功能和相关机制仍不清楚。聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）蛋白是经典的血管损伤蛋白,内皮损伤的最重要原因之一是氧化应激诱导的PARP1过度激活。目前,PARP1抑制剂用于癌症的临床治疗;然而,有二期评估表明心血管相关的PARP1抑制剂的临床效果较差,这表明PARP1在心血管疾病中的调节机制尚不完全清楚。事实上,PARP1经历了翻译后修饰,我们之前的研究表明Nedd4家族成员WWP2是PARP1的特异性E3泛素连接酶。然而,WWP2-PARP1相互作用的确切机制仍不清楚。本课题探究BAG3在氧化应激相关的内皮损伤中的关键作用,以及BAG3行使这一作用通过下游蛋白和具体的调控机制研究方法:第一部分:从上海南方模式生物获得条件性血管内皮特异性基因型小鼠和BAG3过表达转基因型小鼠,包括Tek Cre+、BAG3Fl/Fl（BAG3-e KO）和Tek Cre-、BAG3Fl/Fl（BAG3-e WT）,以及BAG3-TG和BAG3-WT。通过免疫印迹法Western Blot评估BAG3敲除或过表达效率。在所有小鼠中检查并选择八至十周大的雄性无特异性病原体（SPF）小鼠。在Ang II和Na Cl输注小鼠模型中,将BAG3-e WT、BAG3-e KO、BAG3-WT、BAG3-TG（6只/组）随机分组,进行内皮损伤和血管重塑诱导造模。小鼠在异氟醚麻醉后通过断头进行安乐死。取小鼠血管组织样本,用H＆E、Masson三色试剂染色,评价血管厚度和纤维化程度。使用ROS荧光检测方法检测血管内皮细胞的ROS水平。进一步在蛋白水平验证血管内皮损伤情况,包括:PARP1,cleaved-Caspase3的表达情况（凋亡相关蛋白）,Col-1、a-SMA（纤维化相关蛋白）,3-Nitrotyrosine（氧化应激相关蛋白）、OGG1（氧化应激因子）和SOD1（抗氧化应激蛋白）。第二部分:HEK293T细胞转染全长人Flag-BAG3,并进行免疫共沉淀,以通过质谱鉴定与BAG3相互作用的蛋白质,得到与BAG3相互作用蛋白质的基因本体、生物过程、分子功能和细胞成分富集分析。提取PARP1质谱图,进行免疫共沉淀生物学实验验证了BAG3和PARP1之间的相互作用。通过使用抗BAG3抗体验证BAG3与PARP1的相互作用,通过使用抗PARP1抗体验证PARP1与BAG3的相互作用,并确定BAG3和PARP1之间的相互作用在Ang II存在下得以维持。此外,通过BAG3与PARP1各截短结构域进行免疫共沉淀实验,进一步探究PARP1Zinc1-Zinc2结构域、BRCT结构域、PARP A螺旋结构域和PARP催化结构域中的哪个结构域与BAG3相互作用。第三部分:在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中,通过转染Flag-BAG3质粒进行梯度过表达实验,并且构建了慢病毒转染sh BAG3的稳定敲减细胞系,以探究其对内源性PARP1水平的影响。将HUVEC细胞分为两队四组,分别为对照组和Flag-BAG3过表达组、NC组和sh BAG3敲减组。分别用放线菌酮（CHX）和蛋白酶体抑制剂Mg132处理不同时间,用免疫印迹法Western Blot评估PARP1随时间变化的表达水平变化,判断BAG3是通过转录途径还是蛋白酶体降解途径调节PARP1的。再通过免疫共沉淀验证BAG3的外源表达对PARP1泛素化的影响。接下来,在过表达Flag-BAG3的HUVEC细胞与sh BAG3敲减细胞系中通过免疫共沉淀实验验证WWP2和PARP1之间的相互作用水平的变化,以探究WWP2对PARP1泛素化水平在sh BAG3细胞中和过表达外源BAG3的细胞中的区别。再通过比较PARP1-WT与特异性点突变PARP1的泛素化水平来确定BAG3诱导PARP1的泛素化的具体PARP1修饰位点。结果:第一部分:1.BAG3内皮特异性敲除小鼠显示出显著加重的Ang II相关血管内皮损伤和损伤后重塑,包括血管增厚、血管纤维化和血管ROS生成、血管损伤蛋白PARP1和Cleaved-Caspase3水平显著升高;血管纤维化蛋白Col-1和a-SMA水平显著升高;氧化应激因子3-Nitrotyrosine和OGG1含量显著升高,而Ang II相关抗氧化应激蛋白SOD1的量显著减少。2.BAG3转基因小鼠表现出显著缓解Ang II诱导的血管内皮损伤和损伤后重塑:BAG3转基因（BAG3-TG）小鼠与BAG3-WT小鼠相比,BAG3-TG小鼠在Ang II诱导的血管内皮损伤后,血管增厚、血管纤维化和血管ROS生成显著减轻。与BAG3-WT小鼠相比,BAG3-TG小鼠显著降低了Ang II诱导的血管损伤因子PARP1和Cleaved-Caspase3的水平;与BAG3-WT小鼠相比,BAG3-TG小鼠的Ang II诱导的血管纤维化蛋白Col-1和a-SMA水平显著降低;与BAG3-WT小鼠相比,BAG3-TG小鼠的3-Nitrotyrosine和OGG1水平显著降低,SOD1水平显著升高。第二部分:根据质谱鉴定出BAG3相互作用蛋白质,基因本体、生物过程、分子功能和细胞成分富集分析,发现氧化应激损伤蛋白PARP1可能是BAG3的一种新的关键潜在相互作用蛋白并提取了谱图。接下来,通过免疫共沉淀实验,使用抗BAG3抗体和抗PARP1抗体验证BAG3与PARP1的相互作用,证明了内源性免疫沉淀。同时,我们确定BAG3和PARP1之间的相互作用在Ang II存在下得以维持。不仅如此,免疫共沉淀结果表明,BAG3与PARP1的BRCT结构域（PARP1-BRCT）结合。第三部分:1.BAG3通过泛素化修饰促进PARP1的蛋白酶体途径降解:BAG3过表达梯度的增加与内源性PARP1水平的逐渐降低有关,在HUVEC细胞中敲减BAG3后,内源性PARP1表达水平增加。NC细胞在CHX处理后显示出显著更高的PARP1降解速度（斜率）,而sh BAG3组随着时间的推移保持PARP1的低降解速度;与sh BAG3细胞相比,在NC细胞中施用MG132后,PARP1蛋白积累更快,最终两种细胞PARP1水平大致相同;与对照组相比,MG132处理后BAG3过表达组PARP1蛋白积累的速率和斜率均较低,最终两种细胞PARP1水平大致相同;与对照组相比,CHX处理后BAG3过表达组PARP1的降解速度（斜率）更高。接下来又证实了BAG3的外源过表达促进了PARP1的泛素化,这与通过蛋白酶体途径降解PARP1一致。2.BAG3通过WWP2增强PARP1的泛素化,且修饰位点为K249:与对照细胞相比,在转染了Flag-BAG3的细胞中,E3泛素连接酶WWP2和PARP1之间的相互作用水平增加了2.079倍（***,P＜0.001）。与上述结果一致,WWP2的PARP1泛素化水平在sh BAG3细胞中较低,而在过表达外源BAG3的细胞中较高。实验发现BAG3增强了PARP1-WT但不是PARP1-K249R的泛素化水平,表明BAG3通过增强WWP2对K249位点的泛素化修饰从促进PARP1泛素化降解。结论:1.在小鼠血管内皮中,BAG3表达减少会导致显著加重的氧化应激相关血管内皮损伤和损伤后重塑,相反,BAG3表达增加会导致显著缓解的氧化应激相关的血管内皮损伤和损伤后重塑。2.PARP1是BAG3下游结合蛋白,且BAG3与PARP1的BRCT结构域产生相互作用,在Ang II作用下相互作用增强。3.BAG3增强E3泛素连接酶WWP2与PARP1的相互作用,通过修饰K249泛素化位点,从而增强PARP1的泛素化降解水平,以降低细胞内PARP1的表达水平,对氧化应激诱导的血管内皮损伤起到保护作用。