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目的:肺癌是我国当前发病率最高的肿瘤,在我国肺癌患者中大约86%为非小细胞肺癌(NSCLC)。驱动基因突变理论和靶向药物的成功研制为非小细胞肺癌治疗提出了精准医疗的新概念。作为我国非小细胞肺癌患者的主要驱动基因突变类型,表皮生长因子受体(EGFR)突变占我国非小细胞肺癌患者的28%(2015年统计数据)。靶向表皮生长因子的酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitors,TKIs)是当前携带EGFR突变NSCLC患者的首选治疗药物,但由于TKIs的耐药进展,目前上市的三代TKIs均已出现耐药患者,EGFR-TKIs靶向治疗并未根本的解决EGFR突变的NSCLC的长期生存率。近年来,免疫检查点抗体药物的出现为晚期肿瘤治疗带来曙光,其中程序性死亡蛋白-1及其配体(PD-1/PD-L1)抗体药物在某些种类的肿瘤治疗上取得了里程碑式的重大突破,使这些肿瘤的长期生存率显著升高。但是多项临床研究表明EGFR突变的NSCLC患者对PD-1/PD-L1抗体药物治疗不敏感,反应率极低,这制约了 PD-1/PD-L1抗体药物在EGFR突变的NSCLC患者中的应用。有文献报道在一些EGFR突变的瘤肿中MHC-Ⅰ分子出现下调,并与EGFR突变呈相关性,这可以部分解释EGFR突变NSCLC患者对PD-1/PD-L1抗体不敏感。本课题从临床标本和体外实验中发现EGFR突变激活对MHC-Ⅰ膜表达及抗原提呈系统的影响,而且应用相应的抑制剂可以逆转这些影响。由于TKIs联合PD-1/PD-L1抗体药物的几个临床实验均因严重不良反应而中止,我们的发现或许可以为PD-1/PD-L1抗体药物与EGFR下游的AKT/mTOR通路抑制剂联合用药提高免疫治疗疗效的理论依据,继而探讨联合用药可行性。血根碱(Sanguinarine)是来源于罂粟科紫堇、白屈菜等的中药单体化合物。紫堇与白屈菜全草皆有解毒、止痒之功效,提示他们所含成分可能影响免疫功能。近年来有文献报道血根碱在多种瘤肿细胞株和动物模型中有抗肿瘤作用[1-5],但其抗肿瘤作用机制尚未十分明确。本课题通过计算机分子模拟,免疫学和分子生物学实验证明血根碱可以通过抑制原癌基因EGFR和AKT的活化,继而影响MHC-Ⅰ分子表达,提示其可能提升肺癌免疫治疗疗效。方法:一、选取EGFR突变的病人标本34例,EGFR野生型病人标本20例,进行对CD8和HLA-ABC的免疫组织化学染色。免疫组织化学染色方法如正文所述,染色后,由两名病理医师进行评分结合计算机软件(ImageJ,Image-Pro Plus)计算灰度密度,得出最后评分。二、通过在正常人肺上皮细胞系Beas-2B中转入EGFR突变质粒,构建稳定表达的细胞系,进行蛋白免疫印迹实验(Western Blot)、流式细胞术、免疫荧光等实验方法检测EGFR激活对MHC-Ⅰ、PD-L1相对表达量和膜表达量;在NSCLC细胞系中进行WB、流式细胞术、qRT-PCR等实验方法检测EGFR-TKIs(阿法替尼,奥希替尼)抑制EGFR对肿瘤细胞系MHC-Ⅰ分子胞膜表达及抗原生产和提呈系统的影响。三、通过在NSCLC细胞系中应用EGFR下游信号通路AKT/mTOR抑制剂,运用蛋白免疫印迹实验、流式细胞术、qRT-PCR等实验方法检测下游信号通路抑制剂对MHC-Ⅰ膜表达及抗原生产和提呈系统的影响,进而解释TKI对MHC-Ⅰ胞膜表达及抗原生产和提呈系统影响的机制。四、通过计算机分子模拟,免疫学和分子生物学实验方法验证血根碱对EGFR、AKT磷酸化活化的影响,验证其对MHC-I分子表达和膜转位的影响。结果:一、组织标本免疫组织化学染色结果:CD8染色,统计显示EGFR野生型组与突变组组织浸润的CD8+T淋巴细胞数量未见统计差异;HLA-ABC染色,结果显示EGFR野生型组与突变组的HLA-ABC在抗体染色灰度上未见统计学差异。通过对组织标本的观察,EGFR野生型组与突变组相比,HLA-ABC膜表达明显增加,且差异有统计学意义(P<0.05)。二、将突变的EGFR转入突变的EGFR正常肺上皮细胞系中,相对转入空载体的 Beas-2B-Vector,Beas-2B-CAG-EGFR-19DEL 细胞膜表面 MHC-Ⅰ 减少,PD-L增加,且差异有统计学意义(P<0.05);在NSCLC细胞系中,应用EGFR-TKIs的细胞相对控制组,细胞膜表面MHC-Ⅰ增加,且差异有统计学意义(P<0.05)。EGFR-TKIs增加了 NSCLC细胞系抗原产生过程中所需的蛋白酶体核心酶蛋白PSMB8/9和抗原肽转运进内质网的蛋白转运体(TAP2)的表达水平。三、NSCLC细胞系应用EGFR下游信号通路中AKT/mTOR信号通路抑制剂后,与控制组相比,细胞膜表面MHC-Ⅰ增加,且差异有统计学意义(P<0.05)。其增加胞膜MHC-Ⅰ的作用在同时应用PSMB8/9抑制剂时解除,且差异有统计学意义(P<0.05)。NSCLC细胞系应用AKT/mTOR抑制剂后,增加了抗原产生过程中所需的蛋白酶体核心酶蛋白PSMB8/9和抗原肽转运进内质网的蛋白转运体(TAP2)的表达水平。四、分子模拟结果表明血根碱对突变的EGFR有较高的亲和力,同时其对AKT的亲和力也比较高,通过与两个原癌基因蛋白的结合抑制此两个激酶的激活,从而上调MHC-Ⅰ分子的表达并增加其膜转运。结论:一、组织标本中,EGFR野生型组与突变组有类似的CD8+T淋巴细胞浸润水平,HLA-ABC表达量无明显差异。EGFR突变组与野生型组相比,HLA-ABC膜表达显著降低。二、正常肺上皮细胞系中EGFR激活可以减少膜表面MHC-Ⅰ,增加PD-L1。NSCLC细胞系中,应用EGFR-TKIs可使膜表面MHC-Ⅰ增加。三、NSCLC细胞系中,应用EGFR下游信号通路中AKT/mTOR信号通路抑制剂可使膜表面MHC-Ⅰ增加,其作用在同时应用PSMB8/9抑制剂时解除。四、血根碱通过抑制EGFR和AKT的活化,增加MHC-Ⅰ分子表达和膜转位。