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人胰岛淀粉样蛋白(human islet amyloid polypeptide, hIAPP),胰岛素(insulin, INS)等基因在胰腺β细胞中特异性表达,这是因为这些基因的启动子上存在能与β细胞中特异性表达的转录因子结合的位点。猪胰岛素启动子(porcine insulin promoter,PIP)的增强区域存在与Pdx-1(pancreatic and duodenal homeobox1)、Maf A (v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene)及NeuroDl (neurogenic differentiation1)等转录因子相互结合的顺式作用元件。本研究旨在研究非β细胞-PK15细胞中Pdx-1、MafA及NeuroD1等3种转录因子对体外构建的猪胰岛素启动子结合荧光素酶(luciferase, LUC)调控作用,以及外源hIAPP基因的mRNA和蛋白表达水平,为分析转基因猪内hIAPP表达情况提供有效数据,同时也为在体外细胞水平研究组织特异性表达载体的表达情况提供参考依据。1)转录因子Pdx-1、MafA及NeuroDl组织特异性表达检测。采用荧光定量PCR,对猪胰腺、肝脏、肾脏及肌肉等4种组织内Pdx-1、MafA及NeuroDl等3种转录因子的表达检测显示,在胰腺组织内,Pdx-1、MafA及NeuroDl的基因表达水平分别是肌肉、肝脏及肾脏组织中的100、300及400倍。2)双荧光素酶检测转录因子对PIP的调控作用。体外构建pGL3-Pdx-1、pGL3-MafA及pGL3-NeuroDl过表达载体,将其按不同组合分别转染到PK15细胞中,通过检测pGL3-PIP-LUC过表达载体的双荧光素酶活性,评价3种转录因子及其组合对PIP的调控水平。实验结果发现,3种转录因子对PIP均有不同程度的转录激活作用,MafA和NeuroD1对PIP的调控表现为协同效应,而当3种转录因子共同作用于PIP时,其作用不如MafA和NeuroDl两者组合的作用效果。3)外源hIAPP基因在mRNA和蛋白水平的表达情况。根据双荧光素酶活性的结果,将不同组合的转录因子与pcDNA3.1-PIP-hIAPP过表达载体共转到PK15细胞中,通过检测hIAPP基因在mRNA和蛋白水平的表达情况,实验结果显示,hIAPP在mRNA水平均有较高水平的表达,但是Western blot和放射性免疫分析结果显示hIAPP基因没有表达出成熟蛋白,这可能是由于在PK15细胞内缺乏参与hIAPP基因翻译过程的关键酶,使翻译过程被中断,从而无成熟hIAPP蛋白生成。4)五指山小型猪内源胰岛素基因的检测。采用荧光定量PCR,对五指山小型猪胰腺、肝脏、肾脏及肌肉等4种组织内INS内源基因的表达检测显示,在胰腺组织内,INS基因表达水平分别是肌肉中的840倍、肝脏及肾脏组织中的70和145倍。本研究结果表明与PIP能特异性结合的3种转录因子Pdx-1、MafA及NeuroDl能在PK15细胞内有效地激活PIP的转录作用。在缺乏hIAPP蛋白翻译过程中的关键酶的PK15细胞中,hIAPP基因无法表达出成熟的单体蛋白,为后续研究组织特异性表达载体的表达情况提供了可靠的理论依据。同时,猪内源INS基因在胰腺组织内能特异性高效表达,表明本实验选择的3种转录因子确实能在PK15细胞中特异性激活猪胰岛素启动子的转录活性。