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Nodal蛋白属于TGF-β家族成员,是胚胎发育尤其是早期胚胎诱导的关键信号分了。近年来研究发现,Nodal在多种恶性肿瘤中高水平表达,并在肿瘤细胞的增殖与凋亡、促进肿瘤细胞的侵袭和转移以及在肿瘤细胞的“可塑性”方面发挥重要作用。尽管如此,Nodal在多种肿瘤细胞内究竟发挥怎样的作用,以及如何起作用等方面还有很多亟待削明的问题。
因此,本研究选取低侵袭、低转移性的人乳腺癌细胞MCF-7为绌胞模型,主要从Nodal影响肿瘤细胞迁移的分了机制方面来解析Nodal信号的牛物学功能。
本研究的主要研究结果:
1.构建了原核表达质粒pReceiver-hNodal,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达人Nodal成熟肽;表达的融合蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化后,免疫:BALB/c小鼠制备多克隆抗体。通过间接ELISA、Western blot和免疫细胞化学染色和间接免疫荧光等方法证明了制备的多克隆抗体效价高、特异性强。抗人Nodal成熟肽多克隆抗体的成功制备了,为后续功能实验提供了一有力研究工具。
2.细胞划痕和Transwell肿瘤细胞迁移实验表明,Nodal能抑制MCF-7的体外迁移能力。
3.Nodal能激活Smad2使其发生磷酸化并向细胞核中转运。
4.过表达和加外源rhNodal刺激均能引起E-cadherin显著表达下调,Snail显著表达上调;瞬时干扰Nodal后E-cadherin则显著表达上调,Snail显著表达下调;而间质细胞标志的Vimentin无论是RNA水平还是蛋白水平上的表达均无显著变化。
5.基因表达谱分析发现:加rhNodal处理的MCF-7细胞内E-cadherin(基因标志为CDH1)和Snail的变化趋势与过表达Nodal后一致,即:E-cadherin表达下调、Snail表达上调;Cripto-1、SRC、RAS、MAPK、PI3k、AKT、MMP-9的表达均下调。
本研究的主要结论:
Nodal丰要通过抑制Cripto-1及其不依赖Nodal的信号传导通路影响人乳腺癌细胞MCF-7的迁移能力,Nodal引起的MMP-9的表达下调和抑制性Smad-Smad7的表达上调也可能是部分原因。
本研究的意义:
由于我们的研究发现干扰Nodal信号后能在一定程度上促进不依赖Nodal的Cripto-1信号通路的激活,因此,这提示以Nodal为靶向的干预治疗过程中可能要综合考虑对Cripto-1信号的影响,为选择和制定适当的治疗策略提供了一定的理论依据和指导意义。