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第一部分过敏性哮喘气道炎症持续患儿临床资料及免疫学特征分析
背景：过敏性哮喘(AA)是Th2类炎症介导的疾病，表现为外周血嗜酸性粒细胞(EOS)、呼出气一氧化氮(FeNO)、血清总IgE(tIgE)及过敏原特异性IgE(sIgE)水平升高，其一线治疗方式是吸入糖皮质激素(ICS)。多项研究证实ICS治疗AA患儿可显著降低FeNO，2011年美国胸科协会指南建议使用FeNO监测AA患者气道的炎症，指导其诊断和治疗。然而，一些AA患儿尽管接受了ICS治疗，FeNO水平仍然居高不下，通过改善吸入技巧或者提高ICS用量均不能降低FeNO，气道炎症持续存在，对于这部分患儿的临床资料及免疫学特征，目前尚无研究。
目的：探讨过敏性哮喘患儿规范使用ICS后FeNO持续升高(气道炎症持续)与FeNO下降(气道炎症缓解)两组患儿的临床资料及免疫学特征。
方法：研究对象为2018年8月-2019年3月在重庆医科大学附属儿童医院哮喘专科就诊的AA患儿，年龄6-18岁，皮肤过敏原点刺试验粉尘螨和(或)屋尘螨“+++～++++”。过敏性哮喘诊断参考GINA2018指南，采集患儿的人口学资料、家族过敏史、合并过敏性鼻炎情况、香烟暴露史、生产方式、BMI、C-ACT，同时测定患儿外周血EOS%、FeNO、FEV1%、PC20(气道高反应性)，并且定量测定患者血清总IgE(tIgE)、粉尘螨sIgE(Der f sIgE)、屋尘螨sIgE(Der p sIgE)水平，同时使用ELISA法检测患儿血清骨膜蛋白(Periostin)和IL-4/5/13/17水平。
结果：1、一共收集88例过敏性哮喘患儿，其中53例经过ICS规范治疗。ICS规范治疗AA患儿后肺功能FEV1%显著上升，气道高反应性、FeNO和外周血EOS%显著降低；2、FeNO与外周血EOS%、血清Periostin浓度、tIgE、DerfsIgE及DerpsIgE水平呈正相关；3、FeNOHigh组患儿的年龄、气道高反应性、外周血EOS%、血清Periostin、IL-17水平较FeNOLow组显著升高，而FeNOHigh组的FEV1%较FeNOLow组降低，差异均有统计学意义。
结论：AA患儿规范使用ICS后可按FeNO的高低分为FeNOHigh(气道炎症持续)与FeNOLow(气道炎症缓解)两组，两组患儿的年龄、FEV1%、气道高反应性、外周血EOS%、血清Periostin、IL-17水平有明显差异。
第二部分过敏性哮喘患儿外周血嗜酸性粒细胞转录组差异基因功能分析
背景：吸入糖皮质激素(ICS)是治疗过敏性哮喘(AA)患儿的一线用药，呼出气一氧化氮(FeNO)和外周血嗜酸性粒细胞(EOS)是疗效评估的重要标志物。在治疗中，一部分患儿FeNO很快恢复正常，气道炎症明显好转，但还有一部分患儿FeNO维持在较高水平。本研究在第一部分已经证实，这两类患儿有着不同的临床资料及免疫学特征，但针对该现象背后的机制，目前尚无研究。
目的：探讨AA患儿规范使用ICS后外周血EOS转录组在FeNOHigh组(气道炎症持续)与FeNOLow组(气道炎症缓解)的差异。
方法：在AA患儿FeNOHigh组与FeNOLow组随机各选取3例患儿，分选外周血EOS，提取RNA，进行转录组测序(RNAseq)。
结果：1、EOS的RNAseq结果获得了2.67亿原始序列(raw reads)，其中提取出2.65亿干净有效序列(clean reads)用于后续分析，共有2.38亿(89.52%)reads匹配(mapped)到人类基因组(Homo_sapiens)；2、两组样本间Venn分析，发现两组共表达的基因有12056个，FeNOLow组特定表达基因有632个，FeNOHigh组特定表达的基因有842个；3、基因表达量分析发现两组表达差异的基因有165个，差异基因火山图显示相对于FeNOLow组，FeNOHigh组有77个上调基因和88个下调基因；4、基因集聚类分析提示两组患儿差异基因具有特征性的表达谱；5、KEGG通路富集分析显示Jak-STAT信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、糖磷脂生物合成-lacto和neolacto通路、内吞作用、白细胞跨内皮迁移、趋化因子信号通路在气道炎症持续中发挥重要作用；6、富集通路中差异表达基因功能分析提示CXCR4可能是引起FeNOHigh组气道炎症持续的原因。
结论：AA患儿的外周血EOS的RNAseq结果显示，经ICS规范治疗后，气道炎症持续和气道炎症缓解两组患儿有各自特征性的基因表达谱，差异基因CXCR4可能是引起FeNOHigh组气道炎症持续的原因。
第三部分IL-17-CXCR4-嗜酸性粒细胞介导过敏性哮喘患儿气道炎症持续
背景：近年来随着对哮喘发病机制的深入研究，哮喘分型逐渐从表型到内表型，这有助于哮喘的精准防治。既往根据外周血EOS、血清过敏原sIgE将哮喘分为三个类型：过敏性嗜酸性粒细胞性哮喘、非过敏性嗜酸性粒细胞性哮喘、非过敏性非嗜酸性粒细胞性哮喘。本研究的研究对象过敏性哮喘(AA)即为过敏性嗜酸性粒细胞性哮喘，在第一部分我们发现了AA患儿规范使用ICS治疗后存在气道炎症持续和气道炎症缓解两种内表型，且两种内表型患儿临床资料与免疫学特征有明显不同，在第二部分对这两组患儿的外周血EOS进行RNAseq，发现气道炎症持续和气道炎症缓解两组患儿有各自特征性的基因表达谱，CXCR4可能是气道炎症持续的原因。因此，本部分将进一步探索气道炎症持续的机制，为建立个体化治疗方案提供理论依据。
目的：探索AA患儿气道炎症持续的机制。
方法：入组临床患儿对聚焦的差异基因进行功能验证，并进行相关的体内外实验。
结果：1、入组了23例患儿，对其外周血CXCR4进行基因验证，验证结果与RNAseq结果一致，气道炎症持续组患儿的CXCR4高于气道炎症缓解组患儿；2、外周血CXCR4与外周血EOS%、FeNO呈正相关；3、AA患儿气道炎症持续组血清IL-17与CXCR4、FeNO呈正相关，PBMC上清IL-17水平与FeNO、CXCR4呈正相关；4、气道炎症持续组患儿的血清tIgE、DerfsIgE、DerpsIgE均高于气道炎症缓解组；5、DerpsIgEhigh组的血清IL-17高于DerpsIgElow组，DerpsIgEhigh组血清IL-5/IL-17ratio、PBMC中Th2%低于DerpsIgElow组。
结论：屋尘螨sIgE高水平的过敏性哮喘患儿血清IL-17升高，升高的IL-17上调CXCR4的表达，从而导致患儿气道炎症持续存在。
背景：过敏性哮喘(AA)是Th2类炎症介导的疾病，表现为外周血嗜酸性粒细胞(EOS)、呼出气一氧化氮(FeNO)、血清总IgE(tIgE)及过敏原特异性IgE(sIgE)水平升高，其一线治疗方式是吸入糖皮质激素(ICS)。多项研究证实ICS治疗AA患儿可显著降低FeNO，2011年美国胸科协会指南建议使用FeNO监测AA患者气道的炎症，指导其诊断和治疗。然而，一些AA患儿尽管接受了ICS治疗，FeNO水平仍然居高不下，通过改善吸入技巧或者提高ICS用量均不能降低FeNO，气道炎症持续存在，对于这部分患儿的临床资料及免疫学特征，目前尚无研究。
目的：探讨过敏性哮喘患儿规范使用ICS后FeNO持续升高(气道炎症持续)与FeNO下降(气道炎症缓解)两组患儿的临床资料及免疫学特征。
方法：研究对象为2018年8月-2019年3月在重庆医科大学附属儿童医院哮喘专科就诊的AA患儿，年龄6-18岁，皮肤过敏原点刺试验粉尘螨和(或)屋尘螨“+++～++++”。过敏性哮喘诊断参考GINA2018指南，采集患儿的人口学资料、家族过敏史、合并过敏性鼻炎情况、香烟暴露史、生产方式、BMI、C-ACT，同时测定患儿外周血EOS%、FeNO、FEV1%、PC20(气道高反应性)，并且定量测定患者血清总IgE(tIgE)、粉尘螨sIgE(Der f sIgE)、屋尘螨sIgE(Der p sIgE)水平，同时使用ELISA法检测患儿血清骨膜蛋白(Periostin)和IL-4/5/13/17水平。
结果：1、一共收集88例过敏性哮喘患儿，其中53例经过ICS规范治疗。ICS规范治疗AA患儿后肺功能FEV1%显著上升，气道高反应性、FeNO和外周血EOS%显著降低；2、FeNO与外周血EOS%、血清Periostin浓度、tIgE、DerfsIgE及DerpsIgE水平呈正相关；3、FeNOHigh组患儿的年龄、气道高反应性、外周血EOS%、血清Periostin、IL-17水平较FeNOLow组显著升高，而FeNOHigh组的FEV1%较FeNOLow组降低，差异均有统计学意义。
结论：AA患儿规范使用ICS后可按FeNO的高低分为FeNOHigh(气道炎症持续)与FeNOLow(气道炎症缓解)两组，两组患儿的年龄、FEV1%、气道高反应性、外周血EOS%、血清Periostin、IL-17水平有明显差异。
第二部分过敏性哮喘患儿外周血嗜酸性粒细胞转录组差异基因功能分析
背景：吸入糖皮质激素(ICS)是治疗过敏性哮喘(AA)患儿的一线用药，呼出气一氧化氮(FeNO)和外周血嗜酸性粒细胞(EOS)是疗效评估的重要标志物。在治疗中，一部分患儿FeNO很快恢复正常，气道炎症明显好转，但还有一部分患儿FeNO维持在较高水平。本研究在第一部分已经证实，这两类患儿有着不同的临床资料及免疫学特征，但针对该现象背后的机制，目前尚无研究。
目的：探讨AA患儿规范使用ICS后外周血EOS转录组在FeNOHigh组(气道炎症持续)与FeNOLow组(气道炎症缓解)的差异。
方法：在AA患儿FeNOHigh组与FeNOLow组随机各选取3例患儿，分选外周血EOS，提取RNA，进行转录组测序(RNAseq)。
结果：1、EOS的RNAseq结果获得了2.67亿原始序列(raw reads)，其中提取出2.65亿干净有效序列(clean reads)用于后续分析，共有2.38亿(89.52%)reads匹配(mapped)到人类基因组(Homo_sapiens)；2、两组样本间Venn分析，发现两组共表达的基因有12056个，FeNOLow组特定表达基因有632个，FeNOHigh组特定表达的基因有842个；3、基因表达量分析发现两组表达差异的基因有165个，差异基因火山图显示相对于FeNOLow组，FeNOHigh组有77个上调基因和88个下调基因；4、基因集聚类分析提示两组患儿差异基因具有特征性的表达谱；5、KEGG通路富集分析显示Jak-STAT信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、糖磷脂生物合成-lacto和neolacto通路、内吞作用、白细胞跨内皮迁移、趋化因子信号通路在气道炎症持续中发挥重要作用；6、富集通路中差异表达基因功能分析提示CXCR4可能是引起FeNOHigh组气道炎症持续的原因。
结论：AA患儿的外周血EOS的RNAseq结果显示，经ICS规范治疗后，气道炎症持续和气道炎症缓解两组患儿有各自特征性的基因表达谱，差异基因CXCR4可能是引起FeNOHigh组气道炎症持续的原因。
第三部分IL-17-CXCR4-嗜酸性粒细胞介导过敏性哮喘患儿气道炎症持续
背景：近年来随着对哮喘发病机制的深入研究，哮喘分型逐渐从表型到内表型，这有助于哮喘的精准防治。既往根据外周血EOS、血清过敏原sIgE将哮喘分为三个类型：过敏性嗜酸性粒细胞性哮喘、非过敏性嗜酸性粒细胞性哮喘、非过敏性非嗜酸性粒细胞性哮喘。本研究的研究对象过敏性哮喘(AA)即为过敏性嗜酸性粒细胞性哮喘，在第一部分我们发现了AA患儿规范使用ICS治疗后存在气道炎症持续和气道炎症缓解两种内表型，且两种内表型患儿临床资料与免疫学特征有明显不同，在第二部分对这两组患儿的外周血EOS进行RNAseq，发现气道炎症持续和气道炎症缓解两组患儿有各自特征性的基因表达谱，CXCR4可能是气道炎症持续的原因。因此，本部分将进一步探索气道炎症持续的机制，为建立个体化治疗方案提供理论依据。
目的：探索AA患儿气道炎症持续的机制。
方法：入组临床患儿对聚焦的差异基因进行功能验证，并进行相关的体内外实验。
结果：1、入组了23例患儿，对其外周血CXCR4进行基因验证，验证结果与RNAseq结果一致，气道炎症持续组患儿的CXCR4高于气道炎症缓解组患儿；2、外周血CXCR4与外周血EOS%、FeNO呈正相关；3、AA患儿气道炎症持续组血清IL-17与CXCR4、FeNO呈正相关，PBMC上清IL-17水平与FeNO、CXCR4呈正相关；4、气道炎症持续组患儿的血清tIgE、DerfsIgE、DerpsIgE均高于气道炎症缓解组；5、DerpsIgEhigh组的血清IL-17高于DerpsIgElow组，DerpsIgEhigh组血清IL-5/IL-17ratio、PBMC中Th2%低于DerpsIgElow组。
结论：屋尘螨sIgE高水平的过敏性哮喘患儿血清IL-17升高，升高的IL-17上调CXCR4的表达，从而导致患儿气道炎症持续存在。