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近年来,Adcetris(?)和 Kadcyla(?)等抗体偶联药物(antibody-drug conjugates,ADCs)在临床上取得了显著的成功,再一次证实ADCs是一种对抗癌症的强大武器。但传统的偶联方法通过抗体上赖氨酸残基或链间二硫键还原产生的半胱氨酸残基共价连接细胞毒性药物,所获得的ADCs的药物抗体偶联比(drug to antibody ratio,DAR)和偶联位点的变动性较大,导致较大的异质性。因此,定点偶联技术亟待开发。1直接酶法制备抗体偶联药物Sortase A酶(SrtA)介导的偶联反应能特异性识别LPXTG并连接一系列含寡甘氨酸的底物,但由于野生型SrtA的动力学性质比较差,为保证有效的偶联,需要加大酶的用量,延长反应时间,限制了其广泛应用。前期研究中我们利用野生型SrtA(AN59)催化抗CD20抗体ofatumumab(OFA)定点偶联海兔毒素衍生物(Monomethyl auristatin E,MMAE)制备抗 CD20 抗体偶联药物 OFA-vcMMAE。最近报道筛选出了活性更强的突变型SrtA(7M),我们表达了野生型SrtA(AN59)和突变型SrtA(7M),对含LPETG标签的OFA抗体和寡甘氨酸修饰的MMAE进行偶联探索。在我们的偶联体系中,野生型SrtA(AN59)的转肽活性更好,因而我们用野生型SrtA(△N59)制备了定点偶联物OFA-vcMMAE,DAR为1.4,抗体重链偶联率约为70%,而由于空间位阻轻链偶联率几乎为0。2酶-化学法制备抗体偶联药物为了改善偶联效率,我们联用SrtA转肽反应和点击化学制备抗CD20抗体定点偶联药物OFA-GPN-vcMMAE。首先,我们对OFA抗体进行改造,在抗体轻、重链C-末端与SrtA识别序列LPXTG之间引入一个柔性的短肽连接物(GGGGS),减小C-末端识别位点的空间位阻。另一方面,考虑到寡甘氨酸修饰的毒素药物(GGG-vc-PAB-MMAE)空间位阻较大,我们改用分子量更小的双官能团小分子GGG-PEG-N3(简称GPN,N端为寡甘氨酸,C端为叠氮基团,中间用PEG连接)。先通过SrtA的转肽反应在抗体的LPXTG位点引入叠氮基团,再将含叠氮的抗体与含环辛炔的药物(DBCO-PEG-vc-PAB-MMAE)通过高效、高特异性的环张力促进的叠氮-炔环加成反应(strain-promoted alkyne azide cycloaddition,SPAAC)进行偶联,该反应中叠氮基团与炔基的摩尔比为1:2。这种酶-化学法能有效地控制抗体上药物的偶联位点和个数,与传统的非定点偶联方法相比,制备的ADC在均一性方面有较大提升。与直接酶法相比,不仅提高了 DAR(DAR=3.3),而且降低了价格昂贵的MMAE的用量,在生产过程中减少了易产生危险的有毒废物,更适于工业大规模生产。3抗体偶联药物特异性抗肿瘤活性研究CD20是非内吞性抗原,之前的研究尝试用抗CD20抗体偶联阿霉素、蓖麻毒素链A和脂质体阿霉素等制备ADCs,但由于内吞性差、携带的药物毒性不强,不足以有效抑制肿瘤生长。针对制备的2个抗CD20的ADCs,我们分别在细胞水平和动物模型上调查其体内外特异性抗肿瘤作用。直接SrtA酶法制备的OFA-vcMMAE和酶-化学法制备的OFA-GPN-vcMMAE基本保持对CD20阳性细胞的亲和力,能靶向CD20阳性肿瘤细胞并被其内吞后,在溶酶体中降解,释放出高毒性的MMAE,展示了有效的肿瘤杀伤作用。与直接SrtA酶法制备的OFA-vcMMAE相比,酶-化学法制备的OFA-GPN-vcMMAE具有更好的体内外疗效和安全性。