产前诊断主要目的是为可能出现遗传病或与遗传因素有关的疾病以及具有其他导致畸胎因素的高风险家庭提供充足可靠的信息,使他们能够在妊娠期对异常的胎儿做出自己适当的选择。产前诊断技术根据取材方法不同,可分为创伤性产前诊断与无创性产前诊断。从母体外周血分离胎儿细胞进行产前诊断是近年来无创性产前诊断的研究热点,这些细胞包括滋养层细胞。淋巴细胞。颗粒细胞和有核红细胞。目前的研究认为,胎儿有核红细胞(fetal nucleated red blood cells,FNRBCs)是用于产前诊断最理想的细胞。胎儿有核红细胞的细胞膜表面表达胎儿细胞特异性抗原,为各种分离和富集技术提供了靶点。但由于母血中的胎儿有核红细胞数量极少,因此,采用何种技术或方法对母体外周血中的胎儿有核红细胞进行高效和快速的分离与富集,成为能否将无创性产前诊断在临床上推广应用的关键所在。一□研究目的1.建立半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的方法。2.建立半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的反应场所。3.优化半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的反应条件:半乳糖选择N-乙酰半乳糖(N-acetyle-D-galactosamine,GalNAc),植物血凝素选择大豆凝聚素(soybean agglutinin,SBA)。3.1 N-乙酰半乳糖浓度一定时,优化大豆凝集素的最佳工作浓度。3.2大豆凝集素浓度一定时,优化N-乙酰半乳糖的最佳工作浓度。3.3 N-乙酰半乳糖和大豆凝集素的浓度一定时,优化最佳工作温度。3.4建立检验富集到的FNRBCs的方法。4.半乳糖特异性植物血凝素和流式细胞技术分离和富集FNRBCs,两种方法的对比分析。二□材料方法1.半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的反应体系的建立。2.半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的反应场所的建立与应用。2.1自行开发研制玻片池作为反应场所。2.2玻片池的优化与回收再利用。3.样本选用38-40孕周正常分娩的健康产妇的胎儿脐血,经密度梯度离心法收集富含FNRBCs的胎儿有核细胞层。4.半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞系统的反应条件优化。4.1当包被玻片的N-乙酰半乳糖浓度一定时(100μg/ml),将浓度10,20,30,40,50μg/ml的大豆凝集素分别参与反应与待检测细胞形成“FNRBCs-SBA”复合体,再与覆盖好的玻片结合,形成“FNRBCs-SBA-GalNAc”复合体,从而达到对FNRBCs的分离与富集,通过FNRBCs富集效率的高低来优化大豆凝集素的最佳工作浓度。4.2当大豆凝集素浓度一定时(20μg/ml),将浓度50,100,150,200μg/ml的N-乙酰半乳糖溶液包被玻片,将形成的“FNRBCs-SBA”复合体与不同浓度N-乙酰半乳糖溶液包被的玻片结合,形成“FNRBCs-SBA-GalNAc”复合体,通过FNRBCs富集效率的高低来优化N-乙酰半乳糖的最佳工作浓度。4.3当包被玻片的N-乙酰半乳糖浓度一定(100μg/ml)和参与反应的大豆凝集素浓度(20μg/ml)一定时,通过FNRBCs富集效率的高低优化温度对反应体系的影响。5.半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞系统中分离和富集到的FNRBCs的检测。5.1用瑞式染液染色反应中分离和富集到的细胞,在光学显微镜下观察并计数分离和富集到的FNRBCs。5.2用胎儿血红蛋白(fetal haemoglobin,HbF)特异性荧光抗体染色反应中分离和富集到的细胞,用激光共聚焦显微镜观察并计数分离和富集到的FNRBCs。6.用转铁蛋白受体(transferrinreceptor,CD71)和HbF荧光抗体染色后做流式细胞计数,与半乳糖特异性植物血凝素分离和富集FNRBCs方法做比较。三□主要结果1.初步构建了半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞系统,并通过实验证实了该反应体系能够有效分离和富集胎儿有核红细胞。2.完成了半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞系统的反应场所-玻片池的制备。优化。回收,通过实验证实该反应场所适合分离和富集胎儿有核红细胞。2.1用疏水性塑料材质聚四氟乙烯(Polytetra fluore thy lene,PTFE)制备50×24×10 mm玻片池(slide chamber wall,SCW),与显微镜镜玻片粘贴形成了适合分离和富集FNRBCs的玻片池。2.2通过实验证实玻片池经过分离、洗涤、浸泡可以回收再利用。3.半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞系统的反应条件优化。3.1当包被玻片的N-乙酰半乳糖浓度一定时,将浓度10,20,30,40,50μg/ml的大豆凝集素分别参与反应。通过瑞式染色的研究结果表明:白细胞。FNRBCs和极少数红细胞等均能结合GalNAc溶液包被的玻片上。在反应中的SBA浓度变化范围10-50μg/ml时,粘附到GalNAc溶液包被好的玻片的WBC的比率随SBA浓度的升高呈下降趋势,当SBA浓度10μg/ml时,WBC与有核细胞的比率52.8%,FNRBCs与有核细胞的比率为0.8%。当SBA浓度为20μg/ml时,WBC与有核细胞的比率较低27.7%,FNRBCs与有核细胞的比率最高3.7%。当SBA浓度低于10μg/ml时FNRBCs很难发现,当SBA浓度0μg/ml时没有FNRBCs粘附到GalNAc溶液包被好的玻片上。当SBA浓度高于20μg/ml时,FNRBCs与有核细胞的比率下降。特异性荧光抗体染色的研究结果表明:当SBA浓度10μg/ml时,FNRBCs与有核细胞的比率为2.34±0.48%。当SBA浓度为20μg/ml时,FNRBCs与有核细胞的比率最高6.54±0.56%。当SBA浓度高于30μg/ml时,FNRBCs与有核细胞的比率下降。因此,20μg/ml的SBA浓度是分离和富集FNRBCs的最适浓度。3.2当大豆凝集素浓度20μg/ml时,将浓度50,100,150,200μg/ml的GalNAc溶液包被玻片。通过瑞式染色的研究结果表明:当GalNAc包被玻片浓度为50-200μg/ml时,FNRBCs与有核细胞的比率分别为0.19±0.38%。3.5±1.26%。3.08±0.49%。1.83±0.57%,其中,浓度100μg/ml的GalNAc溶液包被玻片,FNRBCs与有核细胞的比率最高3.5±1.26%。特异性荧光抗体染色的研究结果表明:当GalNAc包被玻片浓度为50-200μg/ml时,FNRBCs与有核细胞的比率分别为0。6.26±0.72%。5.43±0.58%、3.73±0.67%,其中,浓度100μg/ml的GalNAc溶液包被玻片,FNRBCs与有核细胞的比率最高6.26±0.72%。因此,100μg/ml的GalNAc是包被玻片的最佳浓度。3.3浓度100μg/ml的GalNAc包被玻片后,SBA浓度为20μg/ml时,当温度在10℃以下时,通过瑞式染色观察FNRBCs数量少;当温度在30℃以上时,通过瑞式染色观察发现复合体中细胞的胞膜有破裂现象;当温度在18—25℃时,经瑞式染色后复合体中的细胞形态完整,富集到的FNRBCs数量多,18—25℃是分离与富集FNRBCs的最适温度。4.实验组中,通过特异HbF荧光抗体双标染色的研究结果表明:采用浓度100μg/ml的GalNAc包被玻片后,当SBA浓度10μg/ml时FNRBCs与有核细胞的比率2.34±0.48%,当SBA浓度20μg/ml时FNRBCs与有核细胞的比率6.54±0.56%,每组结果数据以x±s表示,经SPSS13.0软件进行两独立样本t检验,P<0.05,差异有统计学意义,通过对两种染色结果的误差限图分析,发现特异性荧光染色鉴别的误差范围小于瑞氏染色鉴别结果。5.用CD71和HbF荧光抗体标记后,流式细胞计数结果表明:在相同的反应条件下,CD71染色标记后流式细胞计数结果3.03±1.41%,HbF染色标记后流式细胞计数结果4.73±2.51%,两组数据经SPSS13.0软件分析差异无统计学意义( P > 0.05)。四□讨论目前,母体外周血中FNRBCs的分离和富集技术包括荧光激活细胞分类法(fluorescence activated cell sorting, FACS)。磁激活细胞分类法(magnet activated cell sorting,MACS)和电荷流式分离(flow cytosorting,CFS)等。已有报道指出大豆凝集素(SBA)是一类可特异性识别和结合半乳糖糖链的植物血凝素。以SBA为代表的植物血凝素可特异性识别和结合血细胞膜表面糖链,由于不同类型的血细胞表面的糖链数量和密度差异大,SBA与不同类型的血细胞的亲和力差异也很大,而FNRBCs表面的半乳糖分子密度高于其它有核细胞。本实验成功设计出了半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的反应体系,并证实该反应体系能够有效从新鲜脐血中分离和富集胎儿有核红细胞。由于“FNRBCs-SBA”复合体可在较低SBA浓度条件下结合于GalNAc溶液包被好的玻片表面,从而达到FNRBCs的分离和富集。实验中在SBA浓度为20μg/ml的前提下,用不同浓度的GalNAc溶液覆盖在玻片上,当GalNAc浓度小于100μg/ml时FNRBCs出现频率低;当GalNAc溶液包被玻片浓度增高,即使细胞表面的SBA较少也能吸附FNRBCs到玻片表面。GalNAc包被玻片浓度为100μg/ml时,胎儿有核红细胞出现频率最高;当GalNAc浓度为200μg/ml时,FNRBCs出现频率低且与粘附到玻片上的有核细胞比例减小。因此,GalNAc溶液包被玻片的最适浓度为100μg/ml。GalNAc浓度为100μg/ml时,将浓度为10-50μg/ml的SBA溶液在相同试验条件下分别参与反应,当SBA溶液浓度为20μg/ml时,FNRBCs出现频率最高。因此,20μg/ml的SBA浓度是分离和富集FNRBCs的最适浓度。在SBA浓度为20μg/ml,GalNAc浓度为100μg/ml时,优化温度对反影响应体系的影响。整个实验环境温度保持在18-25℃内,尤其是实验中应用的PBS缓冲液及离心过程中,温度过底或过高均会导致分离和富集到的胎儿有核红细胞形态改变不易辨认,可能甚至细胞膜破裂发生细胞内容物外溢。分析瑞式染色和特异HbF荧光抗体染色结果,通过对两种染色结果的误差限图分析,发现特异性荧光染色鉴别的误差范围小于瑞氏染色鉴别结果,最大限度保证了特异性和敏感性。有较高的检出效率,但是对整个细胞的形态观察不及瑞氏染色。CD71和HbF荧光抗体标记对照组流式细胞计数结果:CD71和HbF分别染色标记后FNRBCs分后,两组数据经SPSS13.0软件分析差异无统计学意义(P>0.05),说明HbF对胎儿细胞有着与CD71同样的识别能力。同一标本用半乳糖特异性植物血凝素反应体系分离和富集FNRBCs,并用HbF和DAPI双抗体标记染色检验分离富集到的FNRBCs,在反应环境18-25℃,浓度为100g/ml的GalNAc溶液包被玻片,SBA反应浓度为20g/ml时,分离和富集胎儿有核红细胞效率最高6.54±0.56%。五□结论1.建立了半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的方法及反应场所。(1)自行构建了可以回收和再利用的玻片池,并以此作为半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的反应场所。(2)本反应系统中,半乳糖选择N-乙酰半乳糖,植物血凝素选择大豆凝聚素。(3)半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的最佳工作条件是: GalNAc包被玻片浓度为100μg/ml,SBA浓度为20μg/ml,18-25℃反应温度。(4)瑞氏染色和特异HbF荧光抗体染色结果表明,在最佳工作条件下,胎儿有核红细胞的分离和富集效率是3.7±1.8%和6.54±0.56%,两组数据经SPSS13.0统计学软件分析P<0.05,说明特异性荧光染色的方法优于瑞氏染色法。2.用CD71和HbF荧光抗体标记后,流式细胞计数结果。(1) CD71染色标记后流式细胞计数结果3.03±1.41%,HbF染色标记后流式细胞计数结果4.73±2.51%,两组数据经SPSS13.0统计学软件分析,P > 0.05差异无统计学意义,说明HbF与CD71对胎儿有核红细胞的识别能力无差异,实验中用HbF荧光抗体染色是可行的。(2) GalNAc包被玻片浓度为100μg/ml,SBA浓度为20μg/ml,18—25℃反应温度,分离和富集胎儿有核红细胞经HbF荧光抗体染色结果为6.54±0.56%,半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞是一种新型的分离和富集胎儿有核红细胞的方法