前言和背景目前认为,冠心病是一种多基因遗传复杂疾病,肥胖是公认的冠心病危险因素之一。脂肪量与肥胖相关(fat mass and obesity associated, FTO)基因是至今为止研究证实最强最确定的肥胖易感基因。自2007年Frayling首次报道,FTO基因与肥胖相关以来,大量全基因组关联研究证实：在全世界大多数不同人种人群中,FTO基因多态性与体质量指数(BMI)、肥胖、胰岛素抵抗及糖尿病(DM)、代谢综合征、高血压、动脉粥样硬化及C-反应蛋白显著关联。冠心病的病理基础是冠状动脉粥样硬化,其发生发展与遗传和环境因素密切相关,肥胖、糖尿病、炎症等均参与其发病及病情进展,而从某种意义上讲,糖尿病等于冠心病。因此,我们假设冠心病与肥胖、糖尿病可能具有共同的遗传学基础,FTO基因多态性可能与冠心病患病风险相关。据文献检索,目前国内外仅有少数几个学者在FTO基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与2型糖尿病的关联研究中发现：FTO基因SNP与DM合并冠心病有相关性。2010年Hubacek等首次研究表明：在男性白色人种中FTO基因rs17817449多态性与急性冠脉综合征显著相关。而对于非洲印第安人的研究表明：急性心肌梗死并代谢综合征与肥胖相关基因多态性并不相关。对于FTO基因SNP与冠心病的关联研究尚处于不确定阶段,国内尚未见关于FTO基因多态性与冠心病相关性研究的报道,且不同人种具有遗传异质性,全基因组关联研究(GWAS)发现的冠心病易感基因,需要在不同人种大样本研究中得到重复验证。近十年来的研究表明瘦素(leptin)与肥胖、血脂异常、胰岛素抵抗、高血压、动脉粥样硬化等关联,是冠心病的易患因素之一。LEP基因也是肥胖相关基因,编码瘦素,Lep基因与FTO基因同是通过作用于下丘脑,而抑制饮食,调节能量平衡,其基因多态性变异导致肥胖。研究亦证实瘦素与FTO基因存在关联,具体机制尚不清楚。FTO基因与肥胖相关的SNP均大致定位于第1内含子,第1内含子在遗传上被证实具有高度保守性。研究最为深入的位点rs9939609、 rs17817449与其他位点呈强连锁不平衡,且基因型分型研究成功率很高。GWAS目前研究热点,主要是通过疾病易感基因单核苷酸多态性与疾病的关联,研究复杂疾病的遗传机制。因此本实验选择典型位点FTO rs9939609, rs17817449以及LEP rs10954174对其SNPs与冠心病的关系进行研究。本研究采用病例对照的全基因组关联研究方法,首次对中国汉族冠心病患者肥胖相关基因3个SNPs多态性进行分析,采用基因多态性研究可靠性精确度最高的直接测序方法确定FTO、LEP基因SNP位点的基因型,探讨FTO、 LEP基因单核苷酸多态性与冠心病及其相关临床表型(高血压、高血脂、高血糖、高同型半胱氨酸等)的相关性,进一步验证冠心病FTO基因与LEP基因SNP位点风险等位基因,为从基因水平筛查冠心病高危人群提供依据。目的1.重复和验证中国汉族冠心病患者肥胖相关基因FTO基因位点rs9939609(A/T)、rs17817449(G/T)和LEP基因位点rs10954174(G/A)多态性；2.探讨上述3个肥胖相关基因单核苷酸多态性SNPs和冠心病的相关性；3.探讨上述3个SNPs多态性与冠心病相关临床性状(肥胖、高血压、高血脂、糖尿病、高尿酸、高同型半胱氨酸等)的相关性,比较不同基因型的临床代谢、生化指标的差异是否具有统计学意义。对象和方法1.随机选择2012年1月至2012年12月深圳市龙岗中心医院心内科住院冠心病患者147例,男127例,女20例,年龄40～72岁,平均年龄(57.22±10.56)岁。同期住院的98例非CAD患者为对照组,男88例,女10例,年龄38～72岁,平均年龄(54.24±8.49)岁。入选研究对象均为汉族且均签署知情同意书。对所有符合入选标准的研究对象均常规收集下列临床资料：年龄、性别、早发心血管病家族史、高血压、糖尿病、脑卒中等相关病史、饮酒、吸烟史、体力活动和主要饮食习惯等。空腹测量身高、体重、腹围(WC)及血压(blood pressure, BP),计算体质量指数(BMI)=体重(公斤)/身高(米)2(kg/m2)。实验室检查以下生化指标：空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、尿酸(uric acid, UA)、同型半胱氨酸(Homocysteine,HCy)等,采用美国罗氏全自动生化分析仪测定。2.肥胖相关基因基因多态性检测：①基因组DNA的制备：清晨空腹用EDTA抗凝管抽取外周静脉血3ml,采用亚能生物技术(深圳)有限公司全血DNA快速提取试剂盒(25次量)抽提全血基因组DNA。电泳鉴定基因组DNA纯度。②聚合酶链反应(PCR)扩增：设计FTO基因位点rs9939609(A/T)、rs17817449(G/T)和LEP基因位点rs10954174(G/A)各自双向引物。通过PCR扩增相应的目的基因片段,PCR反应总体系30ul,包括:10×rTaq buffer(10×缓冲液)3ul,dNTP(2.5mM)2ul,正向、反向引物(10mM)各1ul, DNA模板2ul,Taq DNA聚合酶(r Taq)0.2ul,50%DMSO1ul,去离子水19.8ul。PCR反应条件：95℃预变性5min后进行PCR循环,PCR循环参数为：95℃变性20sec,55℃退火20sec,72℃延伸30sec,进行30个循环,最后72℃总延伸5min,12℃保存。③测序前DNA模板处理：PCR反应产物电泳鉴定,PCR扩增的目的基因片段,rs9939609扩增的片段长度为226bp; rs17817449为253bp; rs10954174为257bp。PCR产物纯化,按照Millipore公司96纯化板操作流程操作处理。纯化后方可作为测序前DNA模板。④基因型检测采用美国ABI3730型(Applied Biosystem)基因分析仪全自动化测序进行基因多态分型。建立单引物PCR测序反应体系：rs9939609、 rs17817449、rs10954174相应的PCR纯化后产物作为测序模板DNA3μl (30-50ng),单向引物(rs9939609R, rs17817449R, rs10954174F)(3pM)1μl, Bigdye Mix0.5μl, ddH2O0.5μl,总反应体积5μl。反应条件：95℃预变性2min,95℃变性10s,51℃退火10s,60℃延伸190s,25次循环。按照分析仪操作说明,按编程设定程序后自动次序进样,毛细管电泳,激光检测器检测荧光,分析DNA碱基序列,仪器自动数据分析得出样本FTOrs9939609、rs17817449和LEP rs10954174基因型。本实验使用的测序试剂盒是Bigdye荧光标记终止底物循环测序试剂盒,由北京六合华大基因科技股份有限公司协助完成。3.统计学处理：统计分析比较冠心病组和对照组之间基本临床资料的差异,分析FTO基因rs9939609、rs17817449, LEP基因rs10954174各位点等位基因及基因型频率分布,以及FTO、LEP不同基因型频率分布之间各生化、代谢指标的分布差异。采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,两组间比较用独立样本t检验,三组间比较采用one-way ANOVA分析。计数资料以率比较,组间比较用x2检验。以x2检验基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用logistic回归分析不同基因型频率分布与冠心病的关系。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.一般临床资料比较：147例冠心病(病例组)以及98例非冠心病患者(对照组)的一般临床资料比较,年龄、吸烟、高血压病史、高脂血症病史、腰围(WC)、空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)及同型半胱氨酸(HCY),冠心病组均高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。性别、既往糖尿病、痛风史、体质量指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)以及尿酸(UA),在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。2.CAD组和对照组中,FTO基因FTOrs9939609、rs17817449基因型和LEP rs10954174基因型分布频率符合Hardy-Weinberg(H-W)遗传平衡(P>0.05)。3.CAD组和对照组中FTO rs9939609等位基因及基因型频率比较：CAD组147例中,FTO rs9939609TT基因型108例,AT型39例,表达频率分别为73.47%、26.53%,未检测到AA基因型。A等位基因频率为13.27%,T等位基因频率为86.73%。98例对照组中,TT基因型72例,AT型26例,频率分别为73.50%、26.50%,未检测到AA基因型；A等位基因频率为13.30%,T为86.70%。两组基因型及A、T等位基因分布频率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4.CAD组和对照组中FTO rs17817449等位基因及基因型频率比较：CAD组147例中,rs17817449GG基因型7例,GT型35例,TT型105例,表达频率分别为4.8%、23.8%和71.4%,G等位基因频率为16.67%,T为83.33%。对照组98例中,TT基因型83例,占84.7%,GT基因型14例,占14.3%,GG基因型1例,占1%。等位基因频率：T为91.8%,G为8.2%。携带G等位基因的基因型与不携带的纯合子TT基因型比较,冠心病风险增高,是TT基因型的4.85倍(P=0.038, OR=4.85,95%CI:0.587～40.053)携带至少一个G等位基因患冠心病的风险是不携带者的2.250倍(P=0.007,OR=2.250,95%CI:1.239～4.084)。5.CAD组和对照组中LEP rs10954174等位基因及基因型频率比较：147例CAD组LEP基因rs10954174GG基因型137例,占93.2%, GA基因型10例,占6.8%,未检测到AA基因型。G等位基因频率为96.6%,A为3.4%；对照组98例,GG型90例,占91.8%,GA型8例,占8.2%,未检测到AA基因型。等位基因频率：G为95.92%,A为4.08%。CAD组LEP rs10954174A等位基因及GA+AA基因型分布频率低于对照组,两组间差异无统计学意义(P>0.05)。6.FTO基因SNP位点rs9939609和rs17817449呈强连锁不平衡：连锁不平衡检验(D=3.4%,r2=0.97>0.33)。7.3个SNPs不同基因型的临床代谢生化指标比较：FTO基因rs9939609AT+AA基因型的高血压病史、高脂血症病史、BMI、WC、SBP、DBP、 FPG、TC、LDL-C水平均高于TT基因型的,二者比较差异显著(P<0.05)；FTO rs17817449GG基因型的BMI、WC、SBP、LDL-C水平均高于TT基因型的,性别、吸烟史、高血压病史,二者比较均差异显著(P<0.05); LEP基因rs10954174GG基因型与GA+AA基因型比较,所有研究指标包括：性别、年龄、吸烟史、高血压病史、糖尿病史、痛风及高脂血症史、BMI、 WC、SBP、DBP、UA、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C及同型半胱氨酸,差异均无统计学意义(P>0.05)。8. Logistic回归分析结果提示,影响冠心病发病的因素有年龄、腰围(WC)、 BMI、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、HDL-C、吸烟、高脂血症史以及FTO基因rs17817449G等位基因。其中危险因素有体质量指数(BMI)、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、HDL-C、高脂血症史和rs17817449G等位基因。rs17817449G等位基因与冠心病呈相关性(P<0.05,OR值25.81,95%CI：2.348-285),且独立于BMI、WC及高血压病、糖尿病及血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、血尿酸、血同型半胱氨酸等风险因素。结论①FTO基因位点rs9939609(A/T)多态性与冠心病无明显关联,rs9939609A等位基因携带者的高血压病史、高脂血症史、BMI、WC、SBP、DBP、FPG、 TC、LDL-C水平均高于TT基因型的,携带A等位基因可能是冠心病的易感因素。②FTO基因位点rs17817449(G/T)多态性与冠心病显著关联,G等位基因是冠心病的风险基因,携带GG基因型的中国汉族人冠心病患病风险高于TT基因型者。③在中国汉族人群中重复证实FTO rs9939609和rs17817449呈强连锁不平衡。④初步研究得出LEP rs10954174(A/G)多态性与冠心病无明显关联。⑤本研究重复和验证了在中国汉族人中肥胖相关基因FTOrs9939609, rs17817449SNPs多态性与BMI、WC显著相关。LEPrs10954174则与冠心病及冠心病相关性状无明显相关。首次在中国汉族冠心病患者中,对3个SNPs与冠心病患病风险的相关性进行了初步探讨。