干细胞移植是缺血性心脏病和心力衰竭富有潜力的治疗手段,但移植细胞停留率低下严重制约了功能效应的改善,因而提高移植细胞归巢效率具有重要的现实意义。本研究立足于细胞磁靶向研究的最前沿,对外加磁场引导下骨髓问充质干细胞靶向修复损伤心肌进行了系统深入的研究。首先,在通过磁场物理学原理分析永磁铁磁场特性的基础上,对磁标记MSCs的磁响应性进行体外实验研究,发现磁标记MSCs具有很强的磁响应能力,在体外能够被磁场大量捕获,细胞捕获率随磁场强度增强而增加,随流速增加而减少,为磁靶向细胞移植的动物实验提供了理论依据；其次,通过多模态影像学和染色体错配技术对顺向冠脉注射MSCs治疗大鼠心肌损伤进行“磁场强度-疗效”关系的研究,证实外加磁场以磁场强度依赖的方式增强MSCs的停留,首次发现过高的磁场强度并未带来额外的心功能获益,呈现“细胞停留-疗效改善相分离”的矛盾现象,可能与永磁铁的磁场强度呈现横轴极化引发的细胞微栓塞有关；最后,提出经左颈内静脉插管进行小动物逆向冠脉注射细胞的新方法,在此基础上发现外加磁场能够促进心梗大鼠逆向冠脉注射MSCs的停留、植入,进一步减轻左室重塑和改善心功能,而且不存在细胞栓塞的风险。研究结果显示,细胞磁靶向治疗有望成为促进移植细胞归巢的新兴策略。第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养及磁化标记目的：确定超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)和DiR荧光染料标记大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的合适方案。方法：分离、培养和鉴定MSCs后,首先用不同浓度的SPIO标记MSCs24h,权衡标记效率(普鲁士蓝染色、细胞透射电镜检查)和标记毒性确定合适的SPIO标记方案；再以5μg/ml的DiR工作液分别标记悬浮和贴壁状态MSCs,以DAPI标记细胞核,通过荧光显微镜观察标记效率,确定DiR的有效标记浓度。结果：(1)25,50,100μg/ml的SPIO培养液对MSCs的标记效率均接近100%(P>0.05),但是SPIO浓度由25μg/ml增加到50μg/ml时,可见较多蓝染铁颗粒黏附于细胞表面,少数游离于细胞外；当培养液SPIO浓度进一步增加到100μg/ml时,较多铁颗粒游离出细胞外,而且出现少数细胞溶解。以“25:0.75μg/ml SPIO-PLL24h方案”标记MSCs,电镜检查显示胞质内有含铁致密颗粒囊泡,细胞超微结构未见破坏。(2)依据荧光显微镜观察显示DiR记MSCs的效率接近100%,确定‘’5μg/ml的DiR工作液”能够有效标记MSCs。结论：权衡标记效率和标记毒性,确定“25:0.75μg/ml SPIO-PLL24h标记方案”和“5μg/ml DiR工作液”可高效、安全标记大鼠MSCs。第二部分永磁铁的磁场特性和磁标记间充质干细胞的体外磁响应性研究目的：阐明圆柱体永磁铁的磁场特性,明确体外静态及流态磁标记MSCs的磁响应能力。方法：对永磁铁的磁场特性进行磁场物理学分析；对静态磁标记MSCs施加0.21T的环形磁铁,通过磁共振成像及倒置相差显微镜观察细胞在磁场中的再分布；1×106磁标记MSCs以5mm/s流过一石英管,在中段管壁上分别放置0.15T、0.3T和0.6T的磁铁作为不同强度磁靶向组,对照组未放置磁铁,通过计算细胞捕获率观察不同强度磁场对流态MSCs的捕获效应；对0.6T磁靶向组分别设置4,20,100和500mm/s4种流速,观察不同流速对0.6T磁铁捕获细胞的影响。结果：通过磁场物理学分析得出永磁铁的磁场沿z轴旋转对称,半径(r)不变时,磁感应强度随z的增加而减少；z不变时,磁感应强度从中心(O)到圆柱体侧面逐渐增大,在圆柱体侧面磁感应强度最大,r再继续增大,磁感应强度又逐渐减少。静态磁标记MSCs在磁场作用下重新分布,形成与磁铁半径对应的棕色圆环,磁共振成像显示环行信号缺失区；0.15T、0.3T和0.6T的磁铁对流态磁标记MSCs的捕获率随着磁铁强度的增强而显著提高(分别为44.67%±5.5%、68%±3%和80.3%±1.5%,组间比较P均<0.05),对照组几乎没有细胞被捕获；当流速为4、20、100和500mm/s,0.6T磁铁对磁标记MSCs的捕获率随流速增加而显著减少(分别为85.0%±3.6%、68.7%±4.7%、11.3%±4.5%和1.6%±0.75%,P均<0.01),磁标记MSCs在磁场中的捕获率与流速(v)呈负相关(R=-0.770；P=0.003)。结论：磁标记MSCs具有很强的磁响应能力,在静态和流态情况下能够被磁场大量捕获；细胞捕获率随磁场强度增强而增加,随流速增加而减少；磁标记MSCs在磁场作用下呈横向极化分布,由此引起了我们对磁靶向干细胞移植可能导致或加重微栓塞的担忧。第三部分外加磁场引导下经冠状动脉顺向移植间充质干细胞治疗大鼠缺血心肌的研究目的：为了观察外加磁场对在体移植细胞的靶向停留效果,我们进行了不同强度磁场下经冠状动脉注射骨髓间充质干细胞治疗缺血再灌注大鼠的实验研究。方法：将雌性SD大鼠建立缺血再灌注模型后随机分为5组,每组25只：(1)PBS组：左室内注射PBS；(2)0T组：左室内注射MSCs,未行磁靶向；(3)0.15T组：左室内注射MSCs,使用0.15T的磁铁实施磁靶向；(4)0.3T组：左室内注射MSCs,使用0.3T的磁铁实施磁靶向；(5)0.6T组：左室内注射MSCs,使用0.6T的磁铁实施磁靶向。所有注射的MSCs均取自雄性SD大鼠,细胞量为1×106,均标记SPIO和DiR,注射期间阻断主、肺动脉5秒,对3个磁靶向组分别紧贴靶病变部位处(控制距离0-1mm)放置0.15T,0.3T和0.6T磁铁自注射开始持续至注射后10分钟。通过离体心脏荧光成像和定量PCR检测雄性MSCs的SRY基因来评估停留细胞量,通过组织形态学和心超检测评估心脏的功能学效应。结果：注射后24小时,SRY基因的RT-PCR检测结果显示0.15T、0.3T和0.6T组的细胞停留率分别是0T组的1.45倍、2.76倍和3.86倍(分别为3.75%±0.44%、7.13%±0.28%、9.95%±0.53%和2.58%±0.58%,组间比较P均<0.001),而且磁场强度与细胞停留量之间呈现正相关(R=0.983,P=0.017)。将PBS组作为阴性对照,在细胞移植后24小时,对大鼠心脏进行荧光成像,3个磁靶向组大鼠心脏均探测到比0T组更强的红色荧光(P均<0.001),其中0.6T组的荧光信号最强,0.3T组次之,0.15T组最弱,同RT-PCR的检测结果一致。在细胞移植后3周,与0T组比较,RT-PCR结果显示0.15T组和0.3T组移植细胞植入均显著增多；组织形态学分析和心超结果显示左室重塑明显减弱和左室功能显著改善,尤以0.3T组的治疗效应最强。然而,由于大量微血管栓塞,虽然0.6T组细胞停留率最高,但治疗效应与0T组无显著差别。结论：顺向冠脉移植时,外加磁场以磁场强度依赖的方式增强MSCs的停留,进而得到心脏的功能学获益,但过高的磁场强度则有加重微栓塞的风险,因而并未带来额外的心功能获益,导致“细胞停留-疗效改善相分离”的矛盾现象。第四部分外加磁场引导-下经冠状静脉逆向移植间充质干细胞治疗大鼠缺血心肌的研究目的：为了探索磁靶向能否增强逆向冠脉注射细胞的停留,我们对心梗大鼠进行了外加磁场引导下逆向冠脉注射间充质干细胞的实验研究。方法：使用雌性SD大鼠建立急性心梗模型,选用前端塑形导丝插入左颈内静脉至左侧冠状静脉,再用一导管沿导丝送达左冠状静脉近中段,对心梗大鼠逆向冠脉注射1×106MSCs,在注射期间及注射后10分钟紧贴心脏表面放置0.6T的磁铁,通过SRY基因的RT-PCR检测、心脏磁共振和离体心脏荧光成像等多模态影像学检查来评估心脏停留细胞量,通过组织形态学和心超检测评估心脏的功能学效应。结果：注射后24小时,心脏磁共振成像半定量分析显示磁靶向组大鼠左室前壁的相对信号强度低于无磁靶向组(0.61%±0.06%vs0.88%±0.08%,P<0.01),心脏离体荧光成像显示,磁靶向组荧光信号是无磁靶向组的2.73倍(26222±5102vs9620±1930,P<0.001),RT-PCR显示磁靶向组的细胞停留率是无磁靶向组的2.87倍(P<0.001)；在3周时,RT-PCR显示两组存活的移植细胞均明显下降,但磁靶向组的植入细胞仍然多于无磁靶向组(P<0.001),而且心脏形态学和心超检查显示左室重塑明显减轻,心功能显著改善。结论：磁靶向是一种增强逆向冠状静脉注射细胞停留的新方法,这一方法通过增加移植细胞停留进一步改善缺血心脏的功能,具有潜在的应用前景。