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脑血管疾病是指脑血管病变引起的脑功能障碍。由于脑局部血液循环障碍,导致神经功能缺损综合征。在中国,脑血管病的发病,死亡和致残率日渐上升,与心血管疾病及癌症一起成为威胁人类生存的主要疾病。根据既往流行病学统计资料,我国的脑血管病远比心血管疾病高发,已成为死亡率排第1,2位的疾病。我国城市脑卒中的年发病率和病死率分别为219/10万和116/10万。脑缺血后再灌注对细胞损伤严重,包含复杂的病理机制,且经多途径,多方式相互作用,相互影响,进一步形成网状结构交织,而其中的主要机制尚不完全清楚。因此,对脑缺血再灌注损伤发病主因的探寻仍是该领域研究的重点,以便为其防治提供一定的依据。没食子酰芍药苷(6’-O-galloylpaeoniflorin,GPF)是从毛茛科植物芍药或川赤芍根中提取出的有效成分,具有清热凉血、散瘀止痛之功效。GPF为单萜糖苷类化合物,其分子式为C30H32O15,分子量632.57。芍药苷中的甲醇提取物和乙酸乙酯对1,-1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)自由基和黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶生成系统生成的氧自由基具有清除作用。没食子酰基是将没食子酸的化学结构中的羧基去掉一个羟基后的形式,作为多酚类化合物,易被胃肠道吸收。没食子酰芍药苷有抗氧化,增强认知功能、改善内皮细胞,扩张血管的作用。近年来,越来越多的国内外学者参与到传统中药的研究进程中来,并对没食子酰芍药苷的研究也日渐增多,发现其具有抑制钙离子超载,拮抗氧化自由基的损伤,抑制血小板聚集,改善微循环,减轻神经毒性等多种功能,但对没食子酰芍药苷是否可以通过PI3K/Akt/Nrf2通路减轻缺血再灌注的氧化应激损伤尚未见研究报道。本研究将分为3部分,探讨没食子酰芍药苷在脑缺血再灌注体外及动物模型实验中的保护作用及作用机制。第一部分:GPF减轻脑缺血再灌注损伤引起的氧化应激及炎症反应在本部分研究中,我们在体外观察GPF对PC12细胞缺血再灌注损伤的氧化应激、炎症反应和细胞活性的影响。通过DCFH-DA检测发现,PC12细胞构建OGD模型后,细胞内绿色荧光表达增强,表明缺血缺氧可诱导PC12细胞中活性氧类(ROS)的大量生成。而GPF可减轻PC12细胞中ROS含量,下调缺血缺氧引起的线粒体膜电位损害效应。并且,GPF可上调SOD活性、下调MDA水平。此结果表明GPF具有减轻OGD模型中的PC12细胞内氧化应激的作用。通过q RT-PCR和ELISA检测发现,PC12细胞缺血缺氧刺激后,细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β表达量明显增加。而经过GPF预处理后,OGD模型中的PC12细胞炎症因子的表达和释放明显减少,且呈剂量依赖性,说明GPF在体外可以减轻PC12细胞缺血缺氧诱导的神经炎症反应。本部分研究的最后,通过CCK-8和LDH活性检测以及凋亡检测,我们发现GPF可减轻OGD模型中的PC12细胞的细胞损伤和凋亡作用。综上,本研究结果显示,GPF可通过减轻PC12细胞缺血缺氧诱导的氧化应激和神经炎症反应,对PC12细胞起到保护作用。但GPF是通过何种机制发挥神经保护作用的尚未完全清楚。本研究第二部分将对GPF的抗氧化和抗炎症作用机制进行进一步探讨。第二部分:GPF通过PI3K/Akt//Nrf2信号通路调控炎症反应和氧化应激在本部分研究中,我们将进一步对GPF抗氧化和抗炎作用的机制作进一步探讨。本研究发现无论是低剂量还是高剂量的GPF均对PC12细胞中Nrf2、Akt表达无明显影响,但经过GPF刺激后,细胞核内Nrf2表达明显增加,并随GPF剂量的增加更为明显,表明GPF可促进Nrf2向核内转移。为观察Nrf2是否参与GPF抗氧化和抗炎能力,本文做了进一步研究。结果显示,RNA干扰技术敲除PC12细胞中的Nrf2后,GPF抗氧化和抗炎能力明显被削弱,并且对PC12细胞缺血缺氧的保护能力也下降。同时给予PI3K特异性抑制剂Ly294002对PC12细胞进行预处理后,观察GPF对Nrf2激活的影响,结果显示,PI3K特异性抑制剂抑制GPF的促Nrf2转核能力。并且PI3K特异性抑制剂还会抑制GPF对OGD模型中的PC12细胞线粒体膜电位和MDA水平以及炎症因子TNF-α和IL-1β的影响,削弱GPF对细胞活性和凋亡的保护作用。综上,本部分研究结果显示,GPF可通过PI3K/Akt信号通路促进Nrf2的激活,发挥抗氧化和抗炎能力从而对缺血缺氧的PC12细胞起到保护作用。然而,体外研究并不能充分说明GPF对缺血性脑血管病的治疗作用。因此,在下一部分研究中我们将进一步观察并探讨GPF对MCAO大鼠脑内氧化应激和炎症反应以及行为学能力的影响。第三部分:GPF对MCAO大鼠的治疗作用及机制研究在前两部分研究中,我们观察并探讨了GPF在体外抗氧化、抗炎和神经保护作用及机制。在本部分研究,我们测试了3种不同剂量GPF对MCAO大鼠行为学和神经病理的影响,结果显示:与正常大鼠相比,MCAO大鼠缺血缺氧明显,促炎介质(IL-1β和TNF-α)和氧化应激标志物MDA水平上升,而抗氧化物质GSH活性下降。给予GPF可改善MCAO大鼠的行为能力,并呈剂量依赖性。并且,GPF可明显减轻大鼠脑组织中炎症因子IL-1β和TNF-α的表达,减轻氧化应激水平。此外,给予PI3K抑制剂可抵消GPF改善MCAO大鼠行为能力、抗氧化和抗炎等神经保护作用。综上,本部分研究显示在动物模型中,GPF通过PI3K/Akt//Nrf2通路的激活减轻MCAO大鼠氧化应激水平和炎症反应,从而对缺血脑组织起到神经保护作用。