斑马鱼(Danio rerio)是一种亚热带的硬骨鱼类,属鲤形目鲤科。斑马鱼具有基因组注释完整、性成熟期短、体外受精和发育、早期鱼体透明等特点。目前,运用众多的免疫细胞标记的转基因品系,可以轻松实现各组织器官中免疫反应的追踪;斑马鱼幼年时期只具备先天免疫的功能,相对来说较为简单;斑马鱼肠道功能与哺乳动物极其相似;因此斑马鱼是研究肠道炎症和损伤分子机制的理想的动物模型。诱导斑马鱼产生肠炎的方式有两种,药物刺激和遗传改造,这些模型的出现,为肠炎的研究工作提供许多有价值的信息。斑马鱼肠道形态发生可分为三个阶段:肠腔形成、肠上皮细胞极化以及肠上皮细胞重构与分化。胚胎受精5天以后,卵黄完全吸收,肠道具有功能,斑马鱼可以通过进食吸收营养物质。根据形态和基因特异性的表达,斑马鱼幼鱼肠道可分为前肠、中肠和后肠。前肠和中肠主要是负责营养物质的吸收,后肠主要负责水分的吸收以及调节渗透压。斑马鱼肠上皮主要有四种细胞类型:吸收性肠细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞和空泡化细胞。其中,吸收性肠细胞是主要的细胞类型,但斑马鱼不具有哺乳动物经典的M细胞(membranous cell)。与哺乳动物相比,斑马鱼肠道结构更为简单,斑马鱼肠上皮缺少隐窝结构,肌肉层直接黏附于粘膜层,不具有组织化的淋巴组织,神经细胞体分布于平滑肌层之间。Beclin1蛋白的结构和功能在多种物种间高度保守。在斑马鱼中,beclin1基因位于12号染色体上,含12个外显子。Beclin1蛋白有447个氨基酸,约为52kDa,含有四个结构域,分别是BH3(Bcl-2 homolog3)域、卷曲螺旋结构域(coiled-coiled domain,CCD)、进化保守结构域(evolutionarily conserved domain,ECD)和核输出结构域(NES),Bcl-2、Vps34、UVRAG、ATG14等均能够与Beclin1上不同的结构域相结合。Beclin1是重要的自噬相关蛋白,与其他蛋白形成复合体参与调控自噬的发生和成熟。Beclin1还能发挥非自噬依赖的功能,主要是调控细胞的内体循环,涉及一些细胞膜上受体的内吞和重新利用。此外,还可以通过参与染色体的稳定、DNA修复、细胞周期、细胞凋亡等方式调控肿瘤的发生和发展。自噬是细胞内重要的降解途径之一,能够清除受损或衰老的细胞器和入侵病原体,降解长寿蛋白,同时也对饥饿、激素失衡和氧化应激等外部环境改变做出适应性调整。已有许多研究表明,自噬参与维持肠道的稳态。自噬可以增强肠上皮细胞的紧密连接,参与黏附连接蛋白的降解,维持肠道抵御病原微生物的第一道屏障。自噬可以通过抑制炎症小体而负调控炎症反应。此外,还可以调控T细胞、B细胞的发育和分化,调控MP细胞(mononuclear phagocytic cell)呈递抗原的过程。肠上皮细胞正常功能的维持离不开自噬,肠上皮杯状细胞的分泌功能和吸收性肠细胞天然的抵御细菌的能力都需要自噬参与。自噬与人类炎症性肠病有密切关联,通过全基因组关联分析,自噬相关基因如ATG16L是人类炎症性肠病的易感基因。本课题旨在研究Beclin1在斑马鱼肠道炎症中的功能。实验主要依托两个转基因品系Tg(mpeg1:eGFP)和Tg(lyz:e GFP),通过免疫组化和荧光实时定量PCR检测肠道炎症相关的指标。同时使用自噬抑制剂-氯喹,辅以荧光标记的小分子化合物dextran等,探究Beclin1发挥调控肠炎的功能是否依赖于自噬途径。本课题以斑马鱼为模式生物,通过CRISPR/Cas9技术敲除了beclin1基因,经筛选得到了突变体。beclin1突变体早期肠道形态和结构基本正常,但在6.5dpf(days post fertilization)肠上皮屏障功能损坏,部分突变体出现肠腔狭窄的表型。在7.5dpf,肠腔狭窄的表型比例显著上升。前肠组织学上的变化主要是肠绒毛结构受到破坏,排列稀疏,上皮细胞多分布在基底侧,细胞核由原来的纺锤状变为圆形,表型严重时还会出现肠道肌肉层增厚。突变体肠道组织发生炎症反应,表现在中性粒细胞和巨噬细胞大量积累,中性粒细胞浸润,免炎症关因子mmp9、tnf-α等转录水平的上调。使用抗生素处理突变体后,免疫细胞的数量和肠腔狭窄的表型有所恢复,但无法挽救肠上皮屏障功能,这提示肠道菌群应该是诱发炎症的主要因素。自噬抑制剂氯喹处理野生型斑马鱼,无法模拟肠上皮屏障损坏的表型。因此Beclin1缺失诱发的肠上皮屏障功能损坏可能不依赖于自噬通路,但这一部分结论还有待进一步验证。本课题中,Beclin1缺失最直接影响是破坏肠上皮屏障的功能,肠上皮功能损坏后肠道菌群入侵导致炎症发生。由于幼鱼个体差异以及肠道炎症发生有强弱之分,所以并不是所有的beclin1突变体都表现肠腔狭窄。Beclin1在肠上皮屏障功能中的作用还有待进一步研究,根据目前的数据,通过自噬途径参与的可能性较小,非自噬依赖途径的可能性较大。人类炎症性肠病有两种亚型,克罗恩病和溃疡性肠炎。根据疾病发生的表型特点,beclin1突变体与克罗恩病在一定程度上相类似,所以beclin1突变体可以对于研究克罗恩病提供一些参考作用。除此以外,Beclin1非自噬功能的研究目前多局限于肿瘤细胞中,在组织器官中研究的内容还较少,本课题可以丰富Beclin1在肠道稳态维持中非自噬功能的内容。