【摘 要】
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吡咯喹啉醌（PQQ）是一种具有热稳定性、水溶性等特点的红褐色醌类化合物。PQQ因其重要的生理功能被广泛应用于农业,食品,医药等领域,具有很好的发展前景。本课题通过前期实验室筛选获得一株吡咯喹啉醌产生菌ZGS-LLP 411,经菌种鉴定为脱氮生丝微菌,命名H.deitrificans LLP 411。以此菌株为出发菌株,本文建立了高效液相色谱法,液相色谱-质谱联用,基于96孔板的GDH酶高效筛选方法
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吡咯喹啉醌（PQQ）是一种具有热稳定性、水溶性等特点的红褐色醌类化合物。PQQ因其重要的生理功能被广泛应用于农业,食品,医药等领域,具有很好的发展前景。本课题通过前期实验室筛选获得一株吡咯喹啉醌产生菌ZGS-LLP 411,经菌种鉴定为脱氮生丝微菌,命名H.deitrificans LLP 411。以此菌株为出发菌株,本文建立了高效液相色谱法,液相色谱-质谱联用,基于96孔板的GDH酶高效筛选方法测定PQQ的体系和PQQ高产菌株筛选模型,以137Csγ射线诱变结合高浓度甲醇平板筛选PQQ高产突变株的方法;通过单因素试验和正交试验对菌种H.denitrificans LLP 411发酵条件和培养基体系进行优化,提高PQQ产量;最后预测生丝微菌属的CRISPR位点,为今后的代谢工程改造打下基础。出发菌株H.denitrificans LLP 411的PQQ最初产率为27.26 mg/L。经发酵条件、培养基成分优化等正交试验,发现Mg2+、谷氨酸、酪氨酸浓度对PQQ合成有显著性影响,PQQ产量提高到78.41 mg/L。通过137Cs γ射线诱变并结合不断提高的高浓度甲醇筛选平板进行复合选育,得到一株耐高浓度甲醇的突变株H7-149,其PQQ产量为产量为116.20 mg/L,比原始菌株产量提高了 48.42%,且具有较好的稳定性。通过甲醇补料,在3L的摇瓶中每12h添加1%的甲醇时,PQQ产量可进一步提高至139.78 mg/L。CRISPR位点分析结果表明,在已测序的13株生丝微菌中共发现59个CRISPR疑似位点,其中有7个确定CRISPR位点。生丝微菌属中CRISPR-Cas系统的类型主要为典型的I-E型和I-C型。只有5.7%的间隔序列与噬菌体显示出较高同源性,表明生丝微菌属基因组比较稳定。本课题的开展为今后PQQ的工业化生产以及PQQ高产菌株的选育及构建具有重要指导意义
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