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研究目的:胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)作为众多疾病的病理生理学基础,其发病机制的研究对于代谢性疾病的防治具有重要意义。有氧运动作为一种有效的干预手段,已成为临床治疗代谢性疾病的重要方法,但关于其作用机制目前尚不完全明确。因此,深入探究有氧运动改善机体能量代谢稳态的机制对于肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病的治疗具有重要意义。Ⅱa型组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDACs)是HDACs家族中的一个亚型,包括HDAC4,HDAC5,HDAC7,HDAC9,其中HDAC4和HDAC5具有运动敏感性,即运动可改变其蛋白的细胞内定位,促使其发生核-质穿梭。不仅如此,还具有调节心血管、骨骼肌、神经和免疫系统的生理功能。这主要得益于其能够在细胞核与细胞质之间穿梭以改变染色体组蛋白乙酰化,从而改变染色体结构,最终影响代谢相关基因的表达。我们的前期研究发现,HDAC4及HDAC5磷酸化可影响其细胞内定位从而影响肉毒碱脂酰转移酶1(Carnitine palmitoyltransferase,CPT1)、过氧化物增殖体受体辅激活子-1(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1,PGC-1α)、葡萄糖转运子4(Glucose transporter 4,GLUT4)等代谢相关基因的表达,提示HDAC4及HDAC5在调节机体能量代谢过程中发挥重要作用。除此之外,我们的前期实验发现,运动可显著减少小鼠比目鱼肌内HDAC4及HDAC5的蛋白含量,而高脂饮食可升高其蛋白含量。因此,我们提出如下假设:除磷酸化修饰外,HDAC4及HDAC5蛋白含量的变化是否也可导致机体的能量代谢变化?有氧运动及高脂饮食干预如何改变HDAC4及HDAC5蛋白含量?作为机体能量调节关键因子,AMPK在运动调节小鼠骨骼肌HDAC5蛋白含量过程中发挥怎样的作用?研究方法:为探究有氧运动干预对IR小鼠能量代谢的影响,我们首先利用8周高脂饮食喂养诱导产生IR小鼠,后将IR小鼠随机分为安静对照组(HC)、长期有氧运动组(HE)、安静+MG132组(HCM)、有氧运动+MG132组(HEM)。并分别在高脂饮食诱导胰岛素抵抗模型建造完成后、有氧运动及腹腔注射20S蛋白酶体抑制剂-MG132干预完成后采用体成分分析仪测定小鼠体重、体脂含量(FM)、去脂体重(FFM)、体质指数(BMI)等指标;取材前,采用ELISA检测各组小鼠血浆胰岛素、胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸水平;利用OGTT实验检测小鼠血糖水平;采用Real-time PCR,探究运动对IR小鼠骨骼肌脂质分解代谢相关基因表达的影响;为探究有氧运动对小鼠骨骼肌有氧代谢能力的影响,对小鼠采取如下的运动干预方案:IR模型建造成功后,对运动组小鼠施以适应性跑台训练,时间为一周,初始速度设定在8-10米/分钟,坡度设置为0,运动时长为30分钟;之后逐渐增速,运动强度维持在小鼠最大摄氧量的75%(75%VO2max),即12米/分钟,60分钟/次,5次/周,总时长为6周。随后,采用Western Blot检测各组小鼠比目鱼肌肌红蛋白(Myoglobin)、细胞色素C(Cytochrome C)、肌钙蛋白(Troponin I)的含量,以检测小鼠骨骼肌的有氧代谢能力;为明确运动对IR小鼠比目鱼肌HDAC4及HDAC5蛋白含量的调节,是否通过增加其蛋白降解,我们采用Real-time PCR检测小鼠比目鱼肌HDAC4及HDAC5的mRNA表达;采用Western Blot检测小鼠比目鱼肌及腓肠肌HDAC4及HDAC5蛋白表达;为探究运动是否通过泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-Proteasome System,UPS)促进IR小鼠比目鱼肌HDAC4及HDAC5泛素化降解,我们对安静或运动状态下的IR小鼠腹腔注射20S蛋白酶体抑制剂-MG132,并采用Western Blot验证抑制剂效果以及抑制蛋白酶体后小鼠比目鱼肌HDAC4及HDAC5表达;抑制剂注射剂量为10μg/kg/d;非-MG132组小鼠腹腔注射药物溶剂0.01%DMSO作为对照,运动前给药,每周给药5天,药物干预时长为6周。为进一步验证泛素-蛋白酶体系统在有氧运动调节IR小鼠比目鱼肌HDAC4及HDAC5蛋白含量过程中的作用,我们采用Co-IP,检测各组小鼠比目鱼肌HDAC4及HDAC5泛素化的变化,以及HDAC4及HDAC5分别与骨骼肌特异性E3-连接酶MuRF1及20S蛋白酶体的结合;为探究AMPK在运动调节小鼠比目鱼肌HDAC5泛素化降解过程中的作用,我们首先建造AMPK敲除小鼠正常安静及长期有氧运动模型。采用Western Blot检测AMPKα2,以验证敲除效率;分别检测骨骼肌有氧代谢相关蛋白Myoglobin,Cytochrome C,Troponin I,以验证运动干预的有效性;检测HDAC5蛋白含量,以探究运动及AMPKα2对小鼠比目鱼肌HDAC5含量的影响。采用Co-IP分别检测各组比目鱼肌HDAC5与K48泛素链,MuRF1,20S蛋白酶体结合量的变化,以验证泛素-蛋白酶体系统在AMPKα2敲除及/或运动状态下,是否参与对HDAC5蛋白含量的调节。研究结果:小鼠体成分及血浆生化结果分析:8周高脂饮食可导致小鼠产生胰岛素抵抗,主要表现为血浆胰岛素水平增加,糖耐量受损,血浆游离脂肪酸、胆固醇、甘油三酯水平显著增加并伴随去脂体重减少、体脂含量及BMI增加;而6周有氧运动可显著逆转上述变化,即降低IR小鼠血浆胰岛素、空腹血糖及餐后血糖、血浆游离脂肪酸、胆固醇、甘油三酯,增加去脂体重,降低体脂及BMI;长期有氧运动对IR小鼠有氧代谢能力的影响:在我们的动物模型内,14周高脂饮食对小鼠骨骼肌有氧代谢蛋白Myoglobin,Cytochrome C,Troponin I并无明显影响,但是6周有氧运动可显著增加IR小鼠骨骼肌上述蛋白的表达,说明有氧运动可显著提高小鼠的有氧代谢能力;有氧运动对IR小鼠比目鱼肌HDAC4及HDAC5 mRNA及蛋白表达的影响:从基因水平上讲,运动对IR小鼠比目鱼肌HDAC4及HDAC5 mRNA并无明显影响;但是从蛋白水平上来讲,与NC组相比,HC组无论是HDAC4或是HDAC5蛋白含量均显著增加,而与HC组相比,HE组显著降低,说明在高脂饮食及运动干预下,HDAC4和HDAC5基因和蛋白水平均不一致。因此,有氧运动对HDAC4及HDAC5蛋白含量的调节可能是通过泛素-蛋白酶体系统增加其泛素化降解实现的;抑制蛋白酶体表达,对HDAC4及HDAC5蛋白含量的影响:腹腔注射-MG132可显著抑制20S蛋白酶体的表达。从蛋白水平上来看,抑制20S蛋白酶体后,无论安静组还是运动组,HDAC4及HDAC5表达均显著增加,说明HDAC4及HDAC5可能通过泛素-蛋白酶体系统降解,但是与HCM组相比,HEM组依旧降低,说明运动调节HDAC4及HDAC5降解,部分依赖于泛素-蛋白酶体系统;抑制蛋白酶体对HDAC4及HDAC5泛素化、与骨骼肌E3-连接酶及20S蛋白酶体结合量的影响:a.泛素化修饰:抑制20S蛋白酶体后,无论安静或者运动状态下,HDAC4 K48泛素化显著增加而HDAC5 K48泛素化显著降低,由此说明,可能由于蛋白酶体功能受到抑制,HDAC4无法降解导致其泛素化标记累积;而HDAC5泛素化标记降低是由于抑制蛋白酶体后,参与降解的HDAC5减少,从而使发生泛素化的HDAC5含量也随之减少;b.与MuRF1结合:与HC组相比,HE组与HCM组HDAC5与MuRF1结合量显著增加,说明有氧运动可增加MuRF1介导的HDAC5泛素化,抑制蛋白酶体可导致MuRF1与HDAC5结合的累积;c.与20S蛋白酶体的结合:与HC组相比,HE组HDAC4与20S蛋白酶体结合增加,而HDAC5无明显变化;与HC组相比,HCM组HDAC4与20S蛋白酶体结合量显著增加,而HDAC5结合量显著降低,说明在IR小鼠比目鱼肌内,有氧运动可促进HDAC4与蛋白酶体结合;但受到20S蛋白酶体蛋白含量的限制,HDAC5与20S蛋白酶体的结合量并没有显著的变化;当抑制蛋白酶体后,HDAC4与蛋白酶体的结合量反而增加,而HDAC5与蛋白酶体的结合量降低;AMPKα2在有氧运动调节骨骼肌HDAC5泛素化降解过程中的作用:对比野生型及敲除小鼠比目鱼肌HDAC5蛋白含量可知,无论是安静还是运动状态下,AMPKα2敲除可显著增加HDAC5蛋白表达。根据CO-IP结果显示,敲除AMPKα2后,HDAC5泛素化,以及与MuRF1、20S蛋白酶体结合量均显著降低,说明敲除AMPKα2可显著抑制HDAC5泛素化标记,从而抑制其通过蛋白酶体降解。