背景:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是遗传-环境-代谢应激相关性疾病,目前其患病率超过慢性病毒性肝病,成为全球第一大慢性肝病。NAFLD疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪变(simple steatosis)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌。一磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)是鞘磷脂代谢的产物之一,在细胞内由鞘胺醇激酶(sphingosine kinase1/2,Sph K1/2)催化产生,作为细胞的重要信号分子,在调节细胞炎症反应及脂质代谢方面发挥着至关重要的作用。S1P受体(sphingosine-1-phosphate receptors,S1PRs)属于G蛋白偶联受体家族,广泛表达在肝脏和肠组织中,与S1P结合,启动细胞跨膜信号转导,调节细胞生长与凋亡,血管再生等各种生理病理过程。前期实验发现,S1PR2m RNA在小鼠、大鼠及人的肝细胞中均呈高水平表达,胆汁酸可与S1PR2结合激活细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK1/2)信号通路,进而调节核转录因子,发挥调节肝细胞糖、脂代谢的效应。天然药物黄连素(俗称小檗碱,berberine,BBR,C20H18NO4)是一种异喹啉类生物碱,作为中草药在中国用于治疗肠道细菌感染导致的腹泻已有数千年历史,具有可以信赖的疗效与安全性。药理学研究表明,黄连素可能具有多种作用靶点和机制,包括降低胆固醇、调控肝脏内参与糖脂代谢的基因表达等,因此本研究应用黄连素治疗NAFLD,观察其疗效其初步探讨作用机制。目前NAFLD发病机制和治疗方法的研究是国际学术界的热点和难点。NAFLD的治疗主要为调整生活方式以及预防和控制合并疾病,即治疗肥胖、高血脂、高血糖、高血压等,尚缺乏有特异性治疗的靶点药物,因此研究、阐明NAFLD发病机制,发现有效的治疗靶标,一直是近年来该领域的研究热点。本课题前期研究发现Sph K2基因敲除小鼠出现严重的脂肪肝;S1PR2基因沉默和敲除均使脂肪酸诱导的小鼠肝细胞内脂质沉积明显减少,因此推测S1P/S1PR2信号是调控肝细胞脂代谢异常的特异靶标之一,黄连素可能通过该机制治疗NAFLD。关于S1PR2在NAFLD发生发展中调控作用的研究目前尚未见文献报道,本课题将分别从整体和离体的水平阐明黄连素治疗NAFLD的疗效并研究S1P/S1PR2的调控机制,为发展NAFLD临床治疗策略以及靶向性药物的研发提供新的思路和靶标。目的:重点阐明BBR在体内外改善NAFLD的脂质沉积及炎症损伤的疗效,并初步探究S1P/S1PR2在黄连素调节脂肪酸诱导的肝细胞脂质沉积中的重要作用,为NAFLD靶向性的药物治疗提供新思路。方法:30只雄性C57BL/6J小鼠,经普通饲料适应性喂养1周后,随机平均分为对照组、高脂饮食组和治疗组(n=10),对照组予以普通饲料,高脂饮食组和治疗组予以高脂饲料。治疗组在第一周开始予200 mg/kg/d黄连素灌胃,对照组和高脂饮食组每日予以等量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃,持续12周,并每周记录小鼠体质量。1.第12周末隔夜禁食,次日麻醉小鼠后摘眼球取血,生化分析仪检测血清生化指标。2.苏木素-伊红(haematoxylin and eosin,HE)染色和油红O染色观察肝脏炎症损伤和脂质沉积等病理变化。3.16S r RNA基因测序检测回盲部肠道菌群改变;酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、S1P和肝组织LPS、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)水平。4.分离、培养小鼠原代肝巨噬细胞,分别予棕榈酸(palmitic acid,PA)、LPS和(或)黄连素处理,电镜观察巨噬细胞超微结构,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测促炎细胞因子表达。5.门静脉灌注法分离、培养小鼠原代肝细胞(mouse primary hepatocyte,MPH),并购买、培养Hep G2细胞,分别设计为四组:空白对照组(CON)、0.5 m M PA组、100 n M S1P+0.5 m M PA组、10μM JTE013(S1PR2拮抗剂)+0.5 m M PA组;油红O染色观察各刺激剂对肝细胞内脂质沉积的作用,并作吸光度(optical density,OD)检测比较各组的差异。6.小鼠MPH予对应处理后,提取细胞RNA和总蛋白,RT-PCR检测S1PR2m RNA表达,蛋白质印迹法(western blotting,WB)检测肝细胞内S1PR2的蛋白表达量。7.分别予以PA和S1P或JTE013预处理MPH 0.5 h,再加用PA造模0.5 h,WB检测肝细胞内ERK1/2与p-ERK的蛋白表达量,验证PA通过S1P/S1PR2激活ERK相关信号通路诱导肝细胞内脂质沉积的假说。结果:1.高脂饮食组小鼠体质量从第6周开始明显增高,趋于肥胖,第12周末体质量为(34.4±3.3)g;治疗组体质量明显降低(P<0.05)。高脂饮食组小鼠肝脏明显增大,表面覆有油脂,治疗组小鼠肝脏湿重较高脂饮食组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2.生化检测结果显示,高脂饮食组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬酸氨基转移酶(aspartate aminoteransferase,AST)、总胆固醇(total Cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)和空腹血糖较对照组明显升高;治疗组ALT、TC、TG和空腹血糖较高脂饮食组有效降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.肝组织HE染色切片观察显示,对照组小鼠肝细胞形态结构完整,肝细胞内未见脂滴;高脂饮食组小鼠肝细胞脂肪变,胞质内出现大小不等的球形脂滴,间质炎性细胞浸润,可见炎症坏死灶融合成片;治疗组小鼠肝小叶脂滴聚集和炎症病灶明显减少。油红O染色结果显示,到高脂饮食组小鼠肝内大颗粒脂滴沉积,治疗组小鼠脂滴数量大幅度减少。4.16S r RNA基因测序物种热图分析肠道菌群相对丰度,结果显示高脂饮食组小鼠肠道菌群组分与对照组相比有较大差异性,治疗组小鼠肠道菌群丰度明显降低;对照组回盲部微生物主要为拟杆菌门(bacteroidetes)厚壁菌门(firmicutes)和变形菌门(proteobacteria),高脂饮食组厚壁菌门和变形菌门减少,治疗组变形菌门和疣微菌门(verrucomicrobia)增加。5.ELISA结果显示,高脂饮食组小鼠血清和肝组织中LPS较对照组明显升高,并且肝组织中IL-6水平较对照组显著增高,治疗组LPS、IL-6水平较高脂饮食组有效降低,差异有统计学意义(P<0.05)。6.电镜观察显示,小鼠原代肝巨噬细胞经PA处理后,可见细胞内明显脂质沉积,胞质中出现大量不规则脂滴;予黄连素和PA联合处理后,巨噬细胞内脂滴有效减少。RT-PCR结果显示,经LPS处理的巨噬细胞,TNF-α、IL-6 m RNA相对表达量较空白对照组显著增高,黄连素明显降低促炎因子的表达水平。7.ELISA结果显示,高脂饮食组小鼠血清S1P较对照组明显升高,黄连素能有效降低小鼠血清S1P,差异有统计学意义(P<0.05)。8.油红O染色与OD检测结果均显示,PA可诱导小鼠原代肝细胞内脂质沉积,胞质中出现大量不规则脂滴;予以JTE013处理后,能明显减少肝细胞内脂滴聚集。9.RT-PCR结果显示,PA能诱导肝细胞内S1PR2 m RNA表达增加,S1P组肝细胞S1PR2 m RNA的表达升高,JTE013可降低S1PR2 m RNA相对表达量;WB结果显示,相对于空白对照组,S1P与PA均能刺激肝细胞内S1PR2的蛋白表达增加,JTE013有效下调S1PR2的表达。10.WB结果显示,与对照组相比,PA明显增加肝细胞内p-ERK的蛋白表达;JTE013能抑制PA诱导的肝细胞内p-ERK的蛋白表达。结论:1.黄连素能减轻NAFLD小鼠模型的肝脏脂质沉积及炎症损伤。2.黄连素能减轻体内外肝细胞炎症损伤,其机制可能与调节肠道菌群、减少LPS生成及抑制肝巨噬细胞炎症因子释放有关。3.黄连素能有效降低高脂饮食诱导的小鼠血清中S1P水平;首次研究发现S1P/S1PR2相关信号通路参与调控NAFLD的发生发展,黄连素对肝细胞的保护作用可能与调节S1P/S1PR2信号通路相关。