丙二酰辅酶A（malonyl-coenzyme A）是脂肪酸类衍产物,黄酮类化合物,聚酮类化合物合成的关键前体化合物,这些化合物在医药类,绿色能源及化工领域有重要的开发价值,因此构建丙二酰辅酶A平台菌株在工业生产中具有巨大潜力。酿酒酵母的遗传背景研究透彻,安全性高,基因操作手段成熟,是微生物工业合成的常用菌株,以酿酒酵母为细胞工厂合成丙二酰辅酶A衍生产品具有很大发展潜力。在酿酒酵母中,中间代谢物丙二酰辅酶A是酯酰辅酶A合成的基本前体物质,酯酰辅酶A随后合成磷脂、三酯酰甘油等为细胞生长繁殖提供必需营养成分。细胞质中乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase）催化生成丙二酰辅酶A是酯酰辅酶A（acyl-CoA）合成的第一步反应,也是限速步骤。乙酰辅酶A羧化酶在转录水平和翻译后水平均受到代谢反馈调控作用,严格的调控使得丙二酰辅酶A的合成效率较低。此外,酯类化合物的合成大量消耗前体物质丙二酰辅酶A,使得胞内丙二酰辅酶A的可利用含量低,上游合成的严格调控与下游途径的消耗使得丙二酰辅酶A的积累量有限,不利于其他衍生化合物的工业合成。目前关于提高丙二酰辅酶A衍生产物合成的研究主要包括增强上游途径的代谢流,全基因组筛选可以提高丙二酰辅酶A水平的基因,弱化代谢途径中的节流支流等手段。其中即使最有效的策略也仅可使丙二酰辅酶A衍生产物产量提高5倍左右,距离实现相关产品的工业生产需求还有很大的距离,因此进一步提高酿酒酵母关键前体化合物丙二酰辅酶A合成的研究对于提高其衍生产物的合成具有重要的意义。本论文首先通过改造转录因子来弱化磷脂合成途径,有效的提高了丙二酰辅酶A在胞内的可利用含量,进而提高了其衍生产物3-羟基丙酸的产量。此外,在酿酒酵母中构建了可响应丙二酰辅酶A浓度的生物传感器,并从多层次优化生物传感器的敏感性和阈值,在此基础上,筛选提高丙二酰辅酶A的合成效率的乙酰辅酶A羧化酶磷酸化位点的突变体。具体研究内容主要有以下几个方面:（1）磷脂合成途径是丙二酰辅酶A的主要消耗途径,但磷脂类化合物是构成生物膜的主要成分,因此不能直接截断磷脂的合成。本研究通过改造调控磷脂合成途径的转录因子来弱化磷脂途径的合成,有效的提高了丙二酰辅酶A的积累量,促进了 3-羟基丙酸的产量。对转录因子的改造通过敲除磷脂合成途径的转录激活因子INO2或INO4,超表达转录抑制因子OPI1。发现INO4的敲除和OPl1的超表达不能提高丙二酰辅酶A衍生产物3-羟基丙酸的合成,但INO2的敲除在导致细胞生长严重受损的情况下使得3-羟基丙酸的产量提高1.8倍,说明Ino2能有效提高单细胞丙二酰辅酶A水平。为恢复细胞生长,进一步提高产物产量,我们在INO2敲除菌中添加磷脂类化合物合成的前体物质胆碱和肌醇,发现细胞生长恢复到野生型菌株生长的50%,并使3-羟基丙酸的产量达到477 mg/L,比野生型菌株提高了 9倍,为目前报道的提高丙二酰辅酶A衍生产物效果最显著的改造。为减少添加额外营养物质的成本,对胆碱和肌醇的添加浓度进行摸索,发现只需添加0.02 mM的胆碱即可恢复生长,并大幅度提高3-羟基丙酸产量。我们进一步探索了不添加营养物也能恢复细胞生长并提高产量的可能性,在INO2敲除菌中表达具有部分活性的INO2突变体,其中表达TAD1突变体使得细胞生长恢复野生型菌的一半水平,同时使得3-羟基丙酸的产量提高1.8倍。说明表达具有部分活性的Ino2可以缓解细胞因磷脂合成不足而生长受损情况,平衡磷脂合成需求与丙二酰辅酶A积累之间的矛盾,并使得代谢流更倾向于流向丙二酰辅酶A的积累。上述研究证明了通过转录水平调控增加丙二酰辅酶A向产物流向的可能性。（2）响应代谢物浓度的生物传感器是加速代谢工程改造的有力工具。基于原核生物中转录因子FapR可特异性的结合丙二酰辅酶A来调控脂肪酸基因转录的原理,我们在酿酒酵母中构建了两套可以响应丙二酰辅酶A浓度的生物传感器,分别可以感应丙二酰辅酶A浓度后激活和抑制转录。第一套生物传感器将FapR的DNA结合位点fapO置于核心启动子的TATA框附近,构建随丙二酰辅酶A浓度增加激活转录的传感系统。我们在该系统中优化了fapO的位置及FapR的表达量,其中性能最佳的系统可以在感应丙二酰辅酶A浓度变化时使得荧光信号输出范围提高到8倍,优于之前文献报道的在酿酒酵母中构建的丙二酰辅酶A感应系统。第二套生物传感器将FapR融合转录激活蛋白,并将fapO置于启动子的上游激活区,获得随着丙二酰辅酶A浓度的升高抑制转录的传感器系统。通过对原始启动子的选择,fapO的位置、数量及激活蛋白的优化,获得不同性能的抑制模式的丙二酰辅酶A生物传感器。本研究构建的两套响应丙二酰辅酶A浓度但信号输出趋势相反的传感器为丙二酰辅酶A代谢途径的调控以及突变体库的筛选提供了潜力工具。（3）乙酰辅酶A羧化酶是酿酒酵母细胞质中合成丙二酰辅酶A的唯一酶,乙酰辅酶A羧化酶除了受转录调控外,还受到严格的翻译后修饰,会被蛋白激酶磷酸化失活,从而限制了丙二酰辅酶A的合成效率。本研究对Acc1蛋白磷酸化修饰位点对酶活的影响做了全面研究,突变了乙酰辅酶A羧化酶上的13个磷酸化位点,并利用构建的高性能激活模式的丙二酰辅酶A生物传感器,筛选提高丙二酰辅酶A合成能力的磷酸化位点突变体。通过对磷酸化位点突变体的筛选,发现了除Ser659,Ser1157外另一个对Acc1活性产生影响的磷酸化位点。在S659AS1157A突变的基础上增加S686A点突变进一步解除了磷酸化抑制作用,使得胞内乙酰辅酶A羧化酶的活性更高,进而促进了丙二酰辅酶A的合成效率,最终得的三点组合突变体Acc1（S686AS659AS1157A）使3-羟基丙酸产量提高1.5倍,高于之前文献报道的Acc1（S659AS1157A）突变体对3-羟基丙酸产量提高的促进作用。本论文通过对关键酶的改造和关键代谢途径的转录调控来加强丙二酰辅酶A合成或弱化丙二酰辅酶A消耗,从而提高酿酒酵母细胞质内丙二酰辅酶A的含量,进而提高丙二酰辅酶A衍生产物3-羟基丙酸的产量。而两套响应丙二酰辅酶A浓度的生物传感器的建立,为进一步进行丙二酰辅酶A代谢调控和突变体的筛选提供了有力的工具。本工作不仅直接提高了 3-羟基丙酸的合成,而且这些平台菌株的建立及生物传感器的构建,对于酿酒酵母合成其他丙二酰辅酶A衍生产物也具有重要的推进作用。此外,丙二酰辅酶A生物传感器的构建和优化对其他代谢物传感器的构建有重要的参考价值。