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多发性骨髓瘤是一种侵袭性造血系统肿瘤,主要表现为骨髓内异常浆细胞过度增生,患者多为老年人,确诊时的平均年龄为68岁,美国NCCN回顾2006年1027名多发性骨髓瘤患者,平均中位生存期大约为33个月,因此,多发性骨髓瘤患者预后较差。迄今为止,多发性骨髓瘤仍被认为是运用目前手段无法治愈的疾病,也是血液系统三大恶性肿瘤(白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤)中尚无法治愈的唯一肿瘤。尽管现在对多发性骨髓瘤的治疗有了很大的进展,但是多数患者仍会复发,也使得现有的治疗受到了制约,极大地消耗了社会卫生资源,因此,探索新的治疗方法提高多发性骨髓瘤患者的预后,甚至使患者得以彻底治愈是目前急需攻克的课题。MUC1是多发性骨髓瘤的肿瘤相关抗原,可在多发性骨髓瘤细胞中异常高表达,且MUC1胞外段的串联重复序列(MUC1-VNTRs)内含有许多抗原识别位点,能诱发机体产生特异性免疫应答。MUC1-VNTRs序列不仅能以MHC限制性还能以MHC非限制性的方式激活CTL,这些活化的CTL可进一步杀伤表达MUC1的多发性骨髓瘤细胞,因此MUC1-VNTRs序列是诱发机体特异性细胞免疫及体液免疫应答的最佳部位。我们利用MUC1胞外段的两串联重复序列(2VNTR).作为靶抗原,以其编码基因构建真核表达载体pcDNA3.1/MUC1-VNTRs/myc-his B作为多发性骨髓瘤的基因疫苗,并体外转染中华仓鼠CHO细胞,用ELISA的方法检测2VNTR序列在哺乳动物细胞中的表达情况,为下一步用构建好的基因疫苗进行动物免疫实验奠定相应的基础。本实验研究共分为两部分:第一部分多发性骨髓瘤MUC1-VNTRs基因疫苗的构建及鉴定研究目的:以多发性骨髓瘤相关肿瘤抗原MUC1胞外段两串联重复序列(2VNTR)作为靶抗原,以其编码基因构建真核表达载体pcDNA3.1/MUC1-VNTRs/myc-his B作为多发性骨髓瘤的基因疫苗,转化入感受态大肠杆菌JM109,体外培养后筛选阳性克隆,并用双酶切进行初步鉴定后,送生物公司测序,证明构建成功。材料和方法:以2VNTR的编码基因作为目的基因,首先对其进行重新设计:在目的基因前加上COZAK促真核翻译序列,两端加上HindⅢ和XBaⅠ酶的酶切位点。设计好的完整基因序列由生物公司合成。然后我们将合成好的2VNTR基因定向克隆入pcDNA3.1/myc-his B多克隆位点的HindⅢ和XBaⅠ酶之间,构建真核表达载体pcDNA3.1/MUC1-VNTRs/myc-his B重组质粒,并转化入感受态大肠杆菌细胞内,在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养,挑选单克隆再进行液体培养,抽提质粒后用HindⅢ和XBaⅠ酶双酶切鉴定有目的片断后,剩余菌液送生物公司测序,以鉴定构建成功。结果:从转化平板上挑取2个克隆进行培养后抽提质粒,用HindⅢ和XBaⅠ酶双酶切后,2%琼脂糖凝胶电泳半小时,紫外线下可见1个克隆在100—200bp之间出现阳性片断,挑取阳性克隆测序鉴定,重组的pcDNA3.1/MUC1-VNTRs/myc-his B含有完整的阅读框架和2VNTR。结论:自行构建好的多发性骨髓瘤2VNTR基因疫苗通过测序证明完全正确。第二部分MUC1-VNTRs基因疫苗的体外转染及在CHO细胞中的表达研究目的:基因疫苗是指将编码外源性抗原的目的基因插入到含真核表达系统的载体上,该目的基因在真核表达载体启动子、增强子的调控下,DNA外源基因可在受体细胞中进行转录、翻译和表达相应的蛋白抗原。表达产物(多肽或蛋白质)被提呈后,与主要组织相容性复合物(MHC)结合,刺激机体产生相应的抗体和导致细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)大量增殖,介导机体的体液免疫及细胞免疫应答,外源目的基因能否在体内有效表达是基因疫苗免疫效果的关键。本试验是通过对已构建好的基因疫苗pcDNA3.1/MUC1-VNTRs/myc-his B进行体外转染CHO细胞株,检测CHO细胞内相应的蛋白质表达情况,为进一步研究该疫苗的动物免疫实验提供直接依据。材料和方法:将制备好的pcDNA3.1/MUC1-VNTRs/myc-his B基因疫苗,进行体外扩增,并用高纯度质粒提取试剂盒进行质粒抽提,然后用脂质体转染的方法将其转染入中华仓鼠卵巢CHO细胞内,同时用GFP质粒作为报告基因转染CHO细胞,并于转染48小时用荧光显微镜观察CHO细胞的转染情况。转染成功后,继续培养细胞,两周后裂解培养的细胞,收集上清液,用ELISA的方法检测相应的2VNTR的表达。结果:将构建好的多发性骨髓瘤2VNTR基因疫苗用脂质体转染的方法转染CHO细胞株,同时以空载体作为阴性对照转染CHO细胞株,两者都以GFP作为报告基因,于转染48小时用荧光显微镜观察CHO细胞,了解转染情况,此时可见细胞内绿色荧光产生,继续培养2周后裂解细胞,收集上清液检测2VNTR的表达。结果显示构建好的2VNTR基因疫苗转染后检出2VNTR的表达,空载体转染后未检出2VNTR的表达。结论:构建好的2VNTR基因疫苗能在哺乳动物细胞内表达VNTR肽,目前的研究可为下一步进行动物免疫试验提供直接的依据。