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目的创伤后的瘢痕增生,是由于细胞外基质的过度沉积或者降解减少而产生,给患者带来疼痛,瘙痒,畸形和甚至毁容等问题。但其产生的生物学调控机制仍然不详,目前临床上并没有较有效的治疗手段。Micro RNA(微小RNA)是一种可在转录后水平调控基因表达的内源性非编码小分子RNA,在前期研究中,我们发现HS(Hypertrophic scar增生性疤痕)组织中mi R-31(Micro RNA-31)表达量最高,它的出现可能会给我们提供新的思路和治疗靶点。HIF1α(hypoxia inhibit factor 1α缺氧诱导因子1α)在近年来的研究中被发现对疤痕的产生有促进作用,但具体机制仍不清楚。本文我们将探索mi R-31与HIF1α是如何促进疤痕的增生,二者间是否存在影响,并通过裸鼠体内试验来验证mi R-31作用的有效性。本实验深入的研究了mi R-31在增生性瘢痕形成中的作用及生物学机制,并为增生性疤痕的预防和临床治疗提供了理论依据和新的切入点。方法1、正常皮肤真皮组织及增生性瘢痕真皮组织的样本采集;福尔马林溶液浸泡后用石蜡进行包埋固定,切片给予HE染色、Masson染色和免疫组化染色;RT-PCR检测正常皮肤真皮组织和增生性瘢痕组织中mi R-31的相对表达差异;WB(western blot)检测NS(Normal skin正常皮肤组织)与HS组织中HIF1α的蛋白表达差异。2、进行人NSFBs(Normal skin fibroblasts正常皮肤成纤维细胞)和HSFBs(Hypertrophic scar fibroblats增生性疤痕成纤维细胞)的培养,RT-PCR对不同代次细胞检测其mi R-31;Fn(Fibronectin纤维链接蛋白);Col1a1(collage1a1胶原1 a1);Col3a1(collage3a1胶原3 a1);TGF-β(Transforming growth factor beta转化生长因子-β)的表达量,验证细胞模型构建的可用性。构建mi R-31过表达干扰载体,并转染入NSFBs;反义干扰载体,并转染入HSFBs。RT-PCR、WB检测转染后细胞的mi R-31;Fn;Col1a1;Col3a1的表达量,从而观察mi R-31对成纤维细胞生物学特性的影响。3、检索生物信息数据库,包括:Targetscan,mi Randa,Pic Tar等,通过计算机运算非翻译区的核苷酸结合度来预测mi R-31的靶基因,筛选与缺氧相关的特定靶基因FIH(Factor inhibit HIF缺氧诱导因子抑制因子)。萤火素酶报告及RT-PCR、WB检测转染后细胞的FIH的表达量,验证mi R-31靶向抑制FIH。4、RT-PCR、WB检测细胞过表达和反义表达mi R-31后,HIF1α;TIMP-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase基质金属蛋白抑制因子1);MMP1(matrix metalloproteinases-1基质金属蛋白酶-1)的表达量,从而观察mi R-31对HIF1α及其下游调控蛋白的影响。5、将HSFBs培养于缺氧的环境中,并于24h;48h;72h三个时间节点检测Fn;Col1a1;Col3a1;TIMP-1;MMP1的蛋白表达量,从而阐明HIF1α促进疤痕增生的原因。6、建立体外裸鼠疤痕模型,观察mi R-31抑制剂局部干预后Fn;Col1a1;Col3a1的表达量变化。结果HS组织及细胞中mi R-31及HIF1α表达量都显著升高,体外实检测到Fn;Col1a1;Col3a1三个纤维化指标的表达量与mi R-31呈正相关,从而得出mi R-31可以促进HS的发生。此外HIF1α与mi R-31在成纤维细胞中有类似的作用,也可以促进纤维化指标的表达,成纤维细胞梯度低氧实验验证了TIMP-1是HIF1α的下游作用基因,与HIF1α的表达正相关。MMP1已多次被验证有促进Fn;Col1a1;Col3a1降解的作用,而TIMP-1是MMP1的抑制因子,所以随着缺氧的加深,纤维化指标的过度表达是通过增强TIMP-1对MMP1的抑制作用而实现的。FIH是缺氧诱导因子的抑制因子,它可以抑制HIF1α对下游基因的转录诱导作用。萤火素酶报告,RT-PCR及WB实验得出FIH是mi R-31的靶基因,并且HIF1α对疤痕的这一促进作用可以被mi R-31所增强。综上我们得出mi R-31增强HIF1α-TIMP-1-MMP1通路促进HS发生。为了进一步验证mi R-31在HS中作用的确定性,设计动物实验。mi R-31抑制剂局部干预裸鼠疤痕后,HE,MASSON及免疫组化染色结果提示Fn;Col1a1;Col3a1的表达量呈下降趋势。结论1、与正常皮肤组织相较,增生性瘢痕中mi R-31的相对表达量增高;2、mi R-31在转录后水平靶向抑制FIH的表达,从而增强HIF1α通路的对增生性瘢痕促进的作用。3、mi R-31抑制剂对裸鼠疤痕有抑制作用。