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目的：
本研究通过Osr2-cre特异性在小鼠CNCCs衍生的舌外周间充质以及下颌咬肌肌腱中（并非下颌骨中）特异性持续激活Fgf8，发现小鼠出现舌形态畸形以及小颌畸形表现，此外还伴发咬肌及其肌腱结构发育异常及缺失。本研究将分为三部分拟解答其中的发生机制，第一部分将重点解答Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌形态畸形的发生机制，第二部分将详细分析Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠小颌畸形表型以及自身发育的机制，探讨下颌骨发育过程中究竟哪些发育事件及重要信号出现异常导致小颌畸形发生;而第三部将初步探索Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠咬肌及其肌腱发育异常及其导致Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠小颌畸形发生的新机制。
方法：
(1)将Osr2-cre及Osr2-cre;Rosa26R-mT/mG小鼠与Rosa26R-Fgf8小鼠交配，分别获得Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8及Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8;mT/mG（均简称Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8）小鼠及Osr2-cre;mT/mG小鼠(下简称WT);将Osr2-cre小鼠与Rosa26R-DTA小鼠交配，获得Osr2-cre;Rosa26R-DTA小鼠;将Myf5-cre小鼠与Rosa26R-mT/mG及Rosa26R-Fgf8小鼠交配，分别获得Myf5-cre;Rosa26R-mT/mG及Myf5-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠;以上各自其余同窝小鼠做对照(WT);(2)将Osr2-cre;mT/mG、Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8;mT/mG及Myf5-cre;Rosa26R-mT/mG小鼠进行冰冻切片及荧光显微镜下拍照观察Osr2-cre(绿色荧光)的表达模式;(3)Masson染色法观察小鼠舌及下颌相关组织学形态;(4)骨（茜素红）/软骨（阿尔新蓝）染色法观察小鼠下颌骨及Merkels软骨结构变化;(5)BrdU标记法检测小鼠舌及下颌相关组织的细胞增殖情况;(6)TUNEL法检测小鼠及下颌相关组织的细胞凋亡情况;(7)原位杂交法检测小鼠舌及下颌相关组织的Tnc、Col1a1、Scx、Tnmd的mRNA表达及分布情况;(8)IHC法检测小鼠舌及下颌相关组织中Myosin、MyoD、Fibronectin、Osterix、p-Smad1/5/8、p-Erk1/2、p-Akt、p-p38、Fgfr1及Lef1等蛋白水平变化及分布情况;(9)WB法检测小鼠舌组织中RhoA蛋白水平改变;(10)测量及计数等均采用Image J软件来进行分析;数据绘图（柱状图）采用GraphPad Prism5软件进行;样本间的数据比较均采用独立样本t检验进行统计学分析，以p＜0.05(*)作为具有统计学差异的标准，p＜0.01（**）及p＜0.001（***）为具有高度统计学差异。
结果：
1.Fgf8激活通过抑制间充质细胞分化导致小鼠舌发育畸形的研究。
(1)Fgf8在舌外周间充质中特异性激活导致Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠表现为明显的“舌伸出”状，舌前部膨隆以及舌后部缩窄;(2)组织学可见Osr2-cre;Rosa26R-Fg小鼠舌形态不规则的改变以及舌后部舌背高耸呈“倒V字”形，舌侧方外周间充质以及舌下纵肌之间的间充质细胞增多，而除舌下纵肌束密度减低以及肌束之间间距增大以外，其余舌肌的排列和分布并无明显差别;(3)另外，可见Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌肌中成肌决定因子MyoD表达无明显差别，舌下纵肌内单个肌纤维（标记Myosin蛋白）密度降低即肌纤维之间距离增大;提示Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌肌自身肌生成可能无明显发育异常，而该小鼠舌形态畸形改变可能与舌间质细胞的异常分化破坏舌肌结构和功能的完整性有关。
(4)Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌下纵肌之间BrdU阳性细胞数增多，提示Fgf8激活能够促进舌间质细胞增殖;(5)Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌中重要外基质蛋白Tnc表达明显下降，而Col1a1以及肌腱分化标记物Scx和Tnmd表达无明显差别，提示Fgf8激活可能通过抑制舌细胞外基质Tnc的分化而影响舌的发育;(6)Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌中FGF信号通路中Fgfr1以及下游胞内p-Erk1/2、p-Akt、p-p38信号蛋白均无明显差别，提示Fgf8激活不是通过以上信号通路影响舌的发育。(7)控制细胞张力及极性的RhoA信号以及细胞表面的重要受体Fibronectin在Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌中表达均明显下降，尤其是舌侧方间充质中Fibronectin明显下降;综上，提示Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌外周激活Fgf8可能通过抑制Fibronectin表达，并抑制RhoA信号，继而抑制舌中细胞外基质Tenascin C的表达，破坏了舌外周间充质细胞表面张力均衡而导致舌形态的畸形改变。
2.Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠小颌畸形表型分析研究
(1)Osr2-cre（绿色荧光）并未在Osr2-cre;mT/mG(WT)小鼠下颌骨中激活，而是在其颊侧的咬肌肌腱上特异性激活，但是Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠却具有明显的下颌短缩、下颌骨短小及表面结构的破坏，即小颌畸形表型;(2)通过对其下颌骨发育过程中一系列发育事件进行详细研究发现，Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠下颌骨原基形成之前凝集的细胞数量明显减少，并且临近肌腱咬肌结构的下颌骨原基上端出现细胞增殖的减少以及成骨分化降低(Osterix);(3)另外早期下颌骨原基外侧控制成骨祖细胞的p-Erk1/2信号以及控制成骨分化过程的经典BMP信号均明显下降，说明Fgf8在小鼠下颌骨颊侧的咬肌肌腱中激活通过抑制下颌骨中ERK信号传导导致下颌骨外周成骨祖细胞群增殖水平降低，并且通过降低下颌骨中经典BMP/Smad信号传导抑制成骨细胞分化过程，进而影响了下颌骨表面结构的生长及矿化成熟，导致Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠小颌畸形的发生。
3.咬肌肌腱特异性激活Fgf8通过抑制肌腱-咬肌复合体分化导致小颌畸形的机制研究
(1)Osr2-cre（绿色荧光）特异性激活在Osr2-cre;mT/mG小鼠下颌骨颊侧附着结构清晰的咬肌肌腱上，而Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8;Rosa26R-mT/mG小鼠相应位置绿色荧光范围明显变大且分布均匀，组织结构也不清晰;(2)Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠出现咬肌肌腱结构退化，肌腱早期分化标记物Scx及分化成熟标记物Tnmd的mRNA表达水平显著下降，并伴发前中后咬肌纤维不同程度的缺失（成熟肌纤维标记物Myosin蛋白下降），咬肌区后部成肌细胞决定因子MyoD表达完全缺失;并且该区域细胞增殖水平显著下降。提示，Fgf8在咬肌肌腱上特异性激活可通过抑制小鼠咬肌肌腱细胞的命运及分化导致肌腱结构缺失，同时抑制肌腱咬肌区细胞增殖水平以及咬肌细胞的成肌命运及肌纤维分化;(3)此外，在Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠肌腱咬肌区，负调控肌腱祖细胞Scx表达的FGF/ERK-MAPK信号中Fgfr1、p-Erk1/2以及经典Wnt/β-catenin信号中Lef1均异常激活;(4)当利用Myf5-cre在所有肌前体细胞中过表达Fgf8后，Myf5-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠咬肌纤维及肌腱仍然在能够分化，但是Myosin染色变浅并且单位面积内肌束数量减少，这间接说明Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠咬肌退化不是Fgf8激活直接引起的，极有可能是由于咬肌肌腱发育障碍直接引起。以上结果均提示Fgf8通过激活Fgfr1/Erk/Wnt抑制肌腱分化，并可能通过分泌的Wnt信号抑制咬肌纤维的细胞命运及肌纤维形成;(5)Myf5-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠下颌骨发育未见明显异常，而使咬肌肌腱细胞发生凋亡的Osr2-cre;Rosa26R-DTA小鼠下颌骨原基变小并且出现骨基质异常，同时伴有前-后部咬肌纤维的不同程度缺失，与Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠十分相似。综上结果提示我们，咬肌肌腱发育异常是导致Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠小颌畸形发生的关键因素，同时也是导致咬肌缺失的直接原因。
结论：
(1)Fgf8在Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌外周间充质中激活通过抑制舌间充质Fibronectin表达，并下调RhoA信号，继而抑制舌细胞外基质Tenascin C的表达，破坏舌外周细胞表面张力均衡而导致舌形态的畸形改变。(2)Fgf8在小鼠咬肌肌腱中特异性持续激活可能是通过激活Fgfr1/Erk/Wnt信号传导通路抑制咬肌肌腱细胞的命运及其分化成熟，导致Osr2-cre;Rosa-Fgf8小鼠咬肌肌腱结构退化消失，同时，可能通过激活Wnt信号抑制其相邻咬肌的形成;(3)而Fgf8激活的Fgfr1/Erk/Wnt信号可能并通过未知机制抑制下颌骨中ERK信号导致下颌骨成骨祖细胞增殖水平下降，通过抑制经典BMP信号(p-Smad1/5/8)成骨分化水平下降，这一系列的异常导致下颌骨形态发生改变而形成小颌畸形。
本研究通过Osr2-cre特异性在小鼠CNCCs衍生的舌外周间充质以及下颌咬肌肌腱中（并非下颌骨中）特异性持续激活Fgf8，发现小鼠出现舌形态畸形以及小颌畸形表现，此外还伴发咬肌及其肌腱结构发育异常及缺失。本研究将分为三部分拟解答其中的发生机制，第一部分将重点解答Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌形态畸形的发生机制，第二部分将详细分析Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠小颌畸形表型以及自身发育的机制，探讨下颌骨发育过程中究竟哪些发育事件及重要信号出现异常导致小颌畸形发生;而第三部将初步探索Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠咬肌及其肌腱发育异常及其导致Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠小颌畸形发生的新机制。
方法：
(1)将Osr2-cre及Osr2-cre;Rosa26R-mT/mG小鼠与Rosa26R-Fgf8小鼠交配，分别获得Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8及Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8;mT/mG（均简称Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8）小鼠及Osr2-cre;mT/mG小鼠(下简称WT);将Osr2-cre小鼠与Rosa26R-DTA小鼠交配，获得Osr2-cre;Rosa26R-DTA小鼠;将Myf5-cre小鼠与Rosa26R-mT/mG及Rosa26R-Fgf8小鼠交配，分别获得Myf5-cre;Rosa26R-mT/mG及Myf5-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠;以上各自其余同窝小鼠做对照(WT);(2)将Osr2-cre;mT/mG、Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8;mT/mG及Myf5-cre;Rosa26R-mT/mG小鼠进行冰冻切片及荧光显微镜下拍照观察Osr2-cre(绿色荧光)的表达模式;(3)Masson染色法观察小鼠舌及下颌相关组织学形态;(4)骨（茜素红）/软骨（阿尔新蓝）染色法观察小鼠下颌骨及Merkels软骨结构变化;(5)BrdU标记法检测小鼠舌及下颌相关组织的细胞增殖情况;(6)TUNEL法检测小鼠及下颌相关组织的细胞凋亡情况;(7)原位杂交法检测小鼠舌及下颌相关组织的Tnc、Col1a1、Scx、Tnmd的mRNA表达及分布情况;(8)IHC法检测小鼠舌及下颌相关组织中Myosin、MyoD、Fibronectin、Osterix、p-Smad1/5/8、p-Erk1/2、p-Akt、p-p38、Fgfr1及Lef1等蛋白水平变化及分布情况;(9)WB法检测小鼠舌组织中RhoA蛋白水平改变;(10)测量及计数等均采用Image J软件来进行分析;数据绘图（柱状图）采用GraphPad Prism5软件进行;样本间的数据比较均采用独立样本t检验进行统计学分析，以p＜0.05(*)作为具有统计学差异的标准，p＜0.01（**）及p＜0.001（***）为具有高度统计学差异。
结果：
1.Fgf8激活通过抑制间充质细胞分化导致小鼠舌发育畸形的研究。
(1)Fgf8在舌外周间充质中特异性激活导致Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠表现为明显的“舌伸出”状，舌前部膨隆以及舌后部缩窄;(2)组织学可见Osr2-cre;Rosa26R-Fg小鼠舌形态不规则的改变以及舌后部舌背高耸呈“倒V字”形，舌侧方外周间充质以及舌下纵肌之间的间充质细胞增多，而除舌下纵肌束密度减低以及肌束之间间距增大以外，其余舌肌的排列和分布并无明显差别;(3)另外，可见Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌肌中成肌决定因子MyoD表达无明显差别，舌下纵肌内单个肌纤维（标记Myosin蛋白）密度降低即肌纤维之间距离增大;提示Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌肌自身肌生成可能无明显发育异常，而该小鼠舌形态畸形改变可能与舌间质细胞的异常分化破坏舌肌结构和功能的完整性有关。
(4)Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌下纵肌之间BrdU阳性细胞数增多，提示Fgf8激活能够促进舌间质细胞增殖;(5)Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌中重要外基质蛋白Tnc表达明显下降，而Col1a1以及肌腱分化标记物Scx和Tnmd表达无明显差别，提示Fgf8激活可能通过抑制舌细胞外基质Tnc的分化而影响舌的发育;(6)Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌中FGF信号通路中Fgfr1以及下游胞内p-Erk1/2、p-Akt、p-p38信号蛋白均无明显差别，提示Fgf8激活不是通过以上信号通路影响舌的发育。(7)控制细胞张力及极性的RhoA信号以及细胞表面的重要受体Fibronectin在Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌中表达均明显下降，尤其是舌侧方间充质中Fibronectin明显下降;综上，提示Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌外周激活Fgf8可能通过抑制Fibronectin表达，并抑制RhoA信号，继而抑制舌中细胞外基质Tenascin C的表达，破坏了舌外周间充质细胞表面张力均衡而导致舌形态的畸形改变。
2.Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠小颌畸形表型分析研究
(1)Osr2-cre（绿色荧光）并未在Osr2-cre;mT/mG(WT)小鼠下颌骨中激活，而是在其颊侧的咬肌肌腱上特异性激活，但是Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠却具有明显的下颌短缩、下颌骨短小及表面结构的破坏，即小颌畸形表型;(2)通过对其下颌骨发育过程中一系列发育事件进行详细研究发现，Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠下颌骨原基形成之前凝集的细胞数量明显减少，并且临近肌腱咬肌结构的下颌骨原基上端出现细胞增殖的减少以及成骨分化降低(Osterix);(3)另外早期下颌骨原基外侧控制成骨祖细胞的p-Erk1/2信号以及控制成骨分化过程的经典BMP信号均明显下降，说明Fgf8在小鼠下颌骨颊侧的咬肌肌腱中激活通过抑制下颌骨中ERK信号传导导致下颌骨外周成骨祖细胞群增殖水平降低，并且通过降低下颌骨中经典BMP/Smad信号传导抑制成骨细胞分化过程，进而影响了下颌骨表面结构的生长及矿化成熟，导致Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠小颌畸形的发生。
3.咬肌肌腱特异性激活Fgf8通过抑制肌腱-咬肌复合体分化导致小颌畸形的机制研究
(1)Osr2-cre（绿色荧光）特异性激活在Osr2-cre;mT/mG小鼠下颌骨颊侧附着结构清晰的咬肌肌腱上，而Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8;Rosa26R-mT/mG小鼠相应位置绿色荧光范围明显变大且分布均匀，组织结构也不清晰;(2)Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠出现咬肌肌腱结构退化，肌腱早期分化标记物Scx及分化成熟标记物Tnmd的mRNA表达水平显著下降，并伴发前中后咬肌纤维不同程度的缺失（成熟肌纤维标记物Myosin蛋白下降），咬肌区后部成肌细胞决定因子MyoD表达完全缺失;并且该区域细胞增殖水平显著下降。提示，Fgf8在咬肌肌腱上特异性激活可通过抑制小鼠咬肌肌腱细胞的命运及分化导致肌腱结构缺失，同时抑制肌腱咬肌区细胞增殖水平以及咬肌细胞的成肌命运及肌纤维分化;(3)此外，在Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠肌腱咬肌区，负调控肌腱祖细胞Scx表达的FGF/ERK-MAPK信号中Fgfr1、p-Erk1/2以及经典Wnt/β-catenin信号中Lef1均异常激活;(4)当利用Myf5-cre在所有肌前体细胞中过表达Fgf8后，Myf5-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠咬肌纤维及肌腱仍然在能够分化，但是Myosin染色变浅并且单位面积内肌束数量减少，这间接说明Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠咬肌退化不是Fgf8激活直接引起的，极有可能是由于咬肌肌腱发育障碍直接引起。以上结果均提示Fgf8通过激活Fgfr1/Erk/Wnt抑制肌腱分化，并可能通过分泌的Wnt信号抑制咬肌纤维的细胞命运及肌纤维形成;(5)Myf5-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠下颌骨发育未见明显异常，而使咬肌肌腱细胞发生凋亡的Osr2-cre;Rosa26R-DTA小鼠下颌骨原基变小并且出现骨基质异常，同时伴有前-后部咬肌纤维的不同程度缺失，与Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠十分相似。综上结果提示我们，咬肌肌腱发育异常是导致Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠小颌畸形发生的关键因素，同时也是导致咬肌缺失的直接原因。
结论：
(1)Fgf8在Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠舌外周间充质中激活通过抑制舌间充质Fibronectin表达，并下调RhoA信号，继而抑制舌细胞外基质Tenascin C的表达，破坏舌外周细胞表面张力均衡而导致舌形态的畸形改变。(2)Fgf8在小鼠咬肌肌腱中特异性持续激活可能是通过激活Fgfr1/Erk/Wnt信号传导通路抑制咬肌肌腱细胞的命运及其分化成熟，导致Osr2-cre;Rosa-Fgf8小鼠咬肌肌腱结构退化消失，同时，可能通过激活Wnt信号抑制其相邻咬肌的形成;(3)而Fgf8激活的Fgfr1/Erk/Wnt信号可能并通过未知机制抑制下颌骨中ERK信号导致下颌骨成骨祖细胞增殖水平下降，通过抑制经典BMP信号(p-Smad1/5/8)成骨分化水平下降，这一系列的异常导致下颌骨形态发生改变而形成小颌畸形。