高压氧(HBO)作为一种临床常用的治疗手段,已广泛地应用于缺血性脑、脊髓损伤,一氧化碳中毒、动脉气体栓塞、减压病等缺血缺氧性疾病的治疗。近年来HBO越来越多地被作为一种预处理因素用于预适应的研究,结果表明HBO预适应对于脑、脊髓和心肌的缺血缺氧性损伤均具有保护作用。由于作为一种预处理手段确实有效,对于缺血缺氧性神经系统疾病的防治,将具有很好的临床应用价值和推广前景,但确切机制尚待阐明。目前认为,HBO预适应诱导的缺血耐受效应,是通过引发适度的氧化应激,以动员机体产生内源性保护反应而实现的。核因子E2相关因子2(Nrf2)及其信号传导通路是氧化应激启动内源性保护反应的关键因素。氧化应激状态下,Nrf2与Keap1分离,从胞浆转移至胞核,与胞核内小Maf蛋白形成异源二聚体后与顺式作用抗氧化剂反应元件(ARE)结合,从而调节II相解毒或抗氧化酶基因的表达。几乎所有具有保护作用的抗氧化基因增强子中均存在ARE,Nrf2为ARE的反式作用因子,在抗氧化基因的表达中发挥了关键性作用。由此推测Nrf2的活化与HBO诱导神经系统的缺血耐受密切相关。星形胶质细胞是中枢神经系统中最多的细胞类型,约占总体积的50%,其数量远远超过了神经元,在提供中枢神经系统代谢和营养支持、维持正常神经元功能、调节突触活性等方面发挥重要作用。由于神经元的抗氧化能力有限,它们大部分都依赖于星形胶质细胞的代谢来对抗氧化应激。因此我们认为,HBO预适应的神经保护作用可能是通过星形胶质细胞内的抗氧化应答来实现的。为探讨星形胶质细胞Nrf2活化在HBO预适应诱导神经系统缺血耐受效应中的关键作用,本课题以小鼠脊髓缺血再灌注(SCIR)损伤模型为基础,从整体动物和细胞水平两个层面,进行了如下研究：第一部分HBO预适应对小鼠脊髓缺血再灌注(SCIR)损伤的保护效应目的：建立稳定的小鼠SCIR损伤模型,确认HBO预适应对小鼠SCIR损伤的保护效应。方法：采用医用纯氧(2.5ATA),持续处理90min后24h,用主动脉弓钳夹法制作小鼠SCIR损伤模型。动物分为Sham组、HBO+SCIR组和SCIR组。采用Basso后肢运动功能评分法,脊髓含水量干湿比重法,运动诱发电位(MEPs), TUNEL法检测脊髓功能和形态的变化。结果：经HBO预适应的小鼠在SCIR损伤后24h、36h、48h时,其后肢运动功能评分显著高于未经HBO适应的SCIR组(7.2±0.8vs5.3±0.5at24h,5.2±0.8vs2.5±0.5at36h,5.0±0.6vs2.0±0.6,at48h,*P<0.01),后肢运动功能保留相对完好；在SCIR损伤48h后,HBO+SCIR组的脊髓含水量显著低于SCIR组(HBO+SCIR70.21±1.79%vs SCIR75.69±1.28%,*P<0.01)；在SCIR损伤1周后,与SCIR组相比,HBO+SCIR组的脊髓MEPs潜伏期显著缩短(SCIR4.4±0.38ms vs.HBO+SCIR3.25±0.3ms,*P<0.01),波幅显著升高(SCIR5.2±0.29μvs.HBO+SCIR8.88±0.74μV,*P<0.01)；在SCIR损伤1周后,HBO+SCIR组和SCIR组的TUNEL阳性细胞数分别为12.2±2.1个细胞／高倍视野和32.5±6.2个细胞／高倍视野,HBO+SCIR组显著降低,同时HBO+SCIR组的casepase-3和casepase-9凋亡酶活性均显著低于SCIR组(HBO+SCIR vs.SCIR,**P<0.01).结论：HBO预适应可减轻SCIR损伤后的后肢运动功能缺失和继发性脊髓水肿,改善MEPs的反应性,抑制或减缓损伤后的细胞凋亡进程,从而发挥对SCIR损伤的神经保护作用。第二部分HBO预适应对脊髓Nrf2转录活性的影响目的：观察HBO预适应后脊髓中Nrf2活性的变化。方法：经HBO预适应后12h和24h,采用Western blot,ELISA,实时定量PCR检测脊髓组织中Nrf2活性的变化。结果：经HBO暴露后12h和24h,小鼠脊髓组织中Nrf2核蛋白含量分别是对照组的4.18±0.71倍和3.27±0.52倍(*P<0.01vs CON):Nrf2的DNA结合活性分别是对照组的8.22±1.1倍和5.03±1.09倍(*P<0.01vs CON)；脊髓组织中Nrf2靶基因谷胺酸半胱氨酸连接酶(GCL),γ谷氨酰转肽酶(γGT),多药耐药相关蛋白1(MRP1)的mRNA表达显著增加,在HBO后12h时,分别是对照组的5.93±0.99倍,3.18±0.69倍和7.42±1.09倍,在HBO后24h时,分别是对照组的4.28±0.86倍,2.47±0.49倍和4.43±1.24倍(*P<0.01vs CON)；脊髓组织中Nrf2靶基因GCL,γGT,MRP1的蛋白表达也显著增加,在HBO后12h时,分别是对照组的3.05±0.53倍,5.03±1.09倍和2.25±0.34倍,在HBO后24h时,分别是对照组的2.82±0.44倍,2.03±0.29倍和2±0.22倍(*P<0.01vs CON)；行假手术或SCIR损伤后各时间点(12h,24h,36h,48h),与Sharn组脊髓组织中谷胱甘肽(GSH)含量相比,SCIR组和HBO+SCIR组中的GSH含量在各个时间点都显著下降,但是HBO+SCIR组中的GSH含量显著高于SCIR组。结论：HBO适应不仅显著提高脊髓组织中Nrf2核蛋白含量,而且其DNA结合活性也一同增加,因此可确认HBO适应后脊髓组织中Nrf2的转录活性增强。Nrf2下游靶基因GCL, γGT, MRP1均是细胞内GSH合成转运的关键蛋白,其mRNA和蛋白含量也显著增加。小鼠SCIR后各时间点,脊髓组织中的GSH含量显著增加,以获得更强的组织抗氧化能力。第三部分星形胶质细胞Nrf2活化对神经元的保护作用目的：验证HBO预适应通过星形胶质细胞Nrf2活化发挥对神经元的保护作用。方法：建立脊髓星形胶细胞和神经元共培养体系,给予氧糖剥夺(OGD)处理模拟体外缺血再灌注损伤,采用MTT比色法,Western blot, ELISA,实时定量PCR检测HBO预适应后细胞中Nrf2活性的变化。结果：在细胞共培养体系中,给予OGD持续90min对星形胶质细胞存活率无显著影响；在星形胶质细胞存在的条件下,HBO预适应可显著提高OGD损伤后神经元的存活率,降低OGD对神经元的损伤作用。HBO预适应可显著提高共培养体系中星形胶质细胞的Nrf2核蛋白含量和DNA结合活性,并同时激活其下游靶基因GCL,γGT,MRP1的表达增强；而神经元中的Nrf2核蛋白含量没有显著变化。HBO预适应可使共培养体系的培养液中GSH含量显著增加,而在仅有神经元的培养体系中,经HBO预适应后,细胞培养液中的GSH含量没有显著变化。结论：星形胶质细胞Nrf2活化在HBO诱导的脊髓缺血耐受中发挥了重要的作用。