柑橘(Citrus)属芸香科植物,在全球热带、亚热带及其中间型的气候地区均有广泛种植。据统计,世界柑橘年产量已达到1.2亿吨,超过苹果、葡萄和香蕉等大宗水果,位居所有水果之首。但柑橘是典型的非跃变型果实,采摘时已接近生理成熟,自身抗病能力较弱,因此柑橘在贮运期间极易受到病原真菌的侵染而爆发大面积的采后病害腐烂,其中,由意大利青霉(Penicillium italicum)引起的青霉病和指状青霉(Penicillium digitatum)引起的绿霉病腐烂最为严重。传统控制采后果蔬病害主要依赖于化学杀菌剂,如噻苯咪唑、多菌灵和抑霉唑等,但长期大量使用合成杀菌剂可能导致化学残留、病原菌耐药性出现和增强、环境污染等问题,甚至会降低食品的安全性。因而寻求绿色环保、无毒副作用的替代方法已经刻不容缓。生物防治,即利用有益微生物或微生物的代谢产物来抑制病原物的生长繁殖,达到防治病害的目的。因其具有安全有效、绿色环保等特点,被认为是最有希望替代化学杀菌剂的方法之一。荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),广泛分布于植物根际土壤和果蔬表面,施用方便,对人和环境无害,是最具应用价值的一类生防菌,而有关P.fluorescens对柑橘果实采后病害及其品质的影响鲜有报道。因此,本试验以高通量筛选获得的P.fluorescens ZX为供试菌株,“北碚447”锦橙果实为试验材料,首先评估P.fluorescens ZX的生存能力、抗菌活性及其对采后锦橙果实青霉病和绿霉病的生防效力,接着通过离体试验(in vitro)和活体试验(in vivo)分析和探讨P.fluorescens ZX的作用机制,最后探究P.fluorescens ZX菌悬液保鲜处理对采后锦橙果实自然腐败及其贮藏品质和感官品质的影响,为P.fluorescens ZX的进一步开发利用提供一定的理论参考。主要研究结果如下:1、采用微生物学技术方法研究P.fluorescens ZX的基本理化性质,评估其生存能力和抗逆能力。结果表明,P.fluorescens ZX的最适生长条件为30℃、中性环境、20 g/L Na Cl,具有一定的耐热性和较高的紫外线抗性及较广的抗生素抗性,但对强酸强碱敏感;P.fluorescens ZX培养4 h后就开始进入对数生长期,具有较强的生命力和环境适应力。2、结合离体试验和活体试验评估P.fluorescens ZX的抗菌活性及其对采后锦橙果实青霉病和绿霉病的生防效力。结果表明,不论是离体试验还是活体试验,P.fluorescens ZX原液和菌悬液都能显著抑制意大利青霉(Penicillium italicum)和指状青霉(Penicillium digitatum)的生长繁殖,P.fluorescens ZX菌悬液在混合固体培养基上和病原菌孢子共同培养时,能完全抑制其生长繁殖,对峙培养时,相对抑菌率达到40%以上;P.fluorescens ZX能有效控制采后锦橙青霉病和绿霉病的发生,延缓病害进程,且菌悬液浓度越高,接种时间越早,生防效果越好;滤液和热杀死液也有一定的防治作用,但其效力远远低于原液和菌悬液。3、结合离体试验和活体试验分析和探究P.fluorescens ZX对采后锦橙青霉病和绿霉病的生防机制,结果表明:(1)光学显微镜和扫描电子显微镜下,和拮抗菌接触共培养后的病原菌,菌丝形态饱满、粗细均匀、表面光滑,没有发现扭曲、变形、空洞、原生质体泄漏等异常情况,说明P.fluorescens ZX对P.italicum和P.digitatum没有寄生作用。(2)与病原菌竞争营养物质和空间位点可能是P.fluorescens ZX发挥生防效力最主要的作用方式,P.fluorescens ZX在果实伤口处经4℃下培养16 d或经20℃下培养8 d后,其活细胞数量分别增长了28倍和34倍;采用插入式细胞培养皿分析拮抗菌和病原菌之间的营养竞争作用,结果显示,P.fluorescens ZX能更快速高效地利用葡萄糖、果糖、蔗糖和游离氨基酸等营养物质,并能分泌嗜铁素,和病原菌竞争果实伤口处有限的铁元素;同时,P.fluorescens ZX生命力强,能在24 h内形成成熟的生物膜,阻碍病原菌接触、利用果实伤口处的营养物质。(3)聚合酶链式反应和琼脂糖凝胶电泳结果显示,P.fluorescens ZX不具有酚嗪-1-羧酸、2,4-二乙酰基间苯三酚、藤黄绿脓菌素、硝咯吡菌素等抗生素或氰化氢的合成基因;分解酶鉴别培养基试验结果表明,P.fluorescens ZX不能分泌几丁质酶、葡聚糖酶和纤维素酶,但能产生蛋白酶;此外,P.fluorescens ZX产生的挥发性次生代谢物质具有较强的抑菌作用,经P.fluorescens ZX熏蒸处理后的果实,青霉病和绿霉病的发病率和病斑直径显著降低。(4)在特定诱导时间范围内,P.fluorescens ZX可显著增强锦橙果实对青霉病和绿霉病的抗性作用,尤其是诱导48 h处理对果实的抗性诱导作用最为显著。进一步分析发现,P.fluorescens ZX处理前期能显著提高锦橙果实中几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶的活性,并能诱导提前β-1,3-葡聚糖酶、过氧化物酶活性高峰的到来;同时,P.fluorescens ZX处理能有效提高果实的内部还原势,诱导果实中一氧化氮、过氧化氢、谷胱甘肽、还原型辅酶Ⅱ、总酚及滨蒿内酯的积累;此外,P.fluorescens ZX处理还能显著抑制果实中脂氧合酶的活性和丙二醛含量的升高,有效抑制或延缓果实的膜脂过氧化。3、利用P.fluorescens ZX菌悬液浸泡果实并监测果实在贮藏前后的品质变化,试验结果表明,P.fluorescens ZX菌悬液保鲜处理能有效阻碍病原微生物的侵入,延缓采后锦橙病害进程,显著延长贮藏时间,且对锦橙的贮藏品质、感官品质及香气成分影响相对较小。上述试验结果表明:供试菌株P.fluorescens ZX能通过营养与空间竞争作用、产生抑菌物质和诱导宿主抗性等多种方式有效抑制P.italicum和P.digitatum的生长繁殖,在采后锦橙青霉病和绿霉病上具有极高的生物防治潜力。