【摘 要】
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目的(1)利用原核表达系统构建重组质粒,表达并纯化获得rh FGF5。(2)构建3D培养的真皮乳头模型,检测rh FGF5对真皮乳头的作用及其与雄激素脱发相关性的初步研究。方法(1)利用p ET3a-rh FGF5/E.coli BL21(DE3)p Lys S表达rh FGF5,经CM阳离子交换柱粗分离,肝素柱亲和层析获得rh FGF5。(2)Western Blot法鉴定rh FGF5,并用N
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目的(1)利用原核表达系统构建重组质粒,表达并纯化获得rh FGF5。(2)构建3D培养的真皮乳头模型,检测rh FGF5对真皮乳头的作用及其与雄激素脱发相关性的初步研究。方法(1)利用p ET3a-rh FGF5/E.coli BL21(DE3)p Lys S表达rh FGF5,经CM阳离子交换柱粗分离,肝素柱亲和层析获得rh FGF5。(2)Western Blot法鉴定rh FGF5,并用NIH/3T3细胞WB法检测rh FGF5活性。(3)酶消化法提取真皮乳头细胞(DPCs)和新生鼠表皮细胞;甲苯胺蓝、阿利新蓝染色和ALP免疫荧光鉴定DPCs。(4)超低粘附力法3D培养DPCs建立真皮乳头微球体DPS;LIVE/DEAD试剂盒检测其细胞活性;q PCR和WB法验证该立体模型功能活性。(5)WB法检测rh FGF5对DPS相关基因的表达调控及与雄激素性脱发的关系。结果(1)利用p ET3a-rh FGF5/E.coli BL21(DE3)p Lys S成功表达出rh FGF5,依次经过CM阳离子交换柱纯化,透析,肝素柱亲和层析获得rh FGF5;利用FGF5抗体鉴定纯化获得的蛋白确为rh FGF5;rh FGF5(20 ng/ml)激活NIH/3T3细胞中FGFR1的磷酸化。(2)酶消化法获得较纯的DPCs和新生鼠表皮细胞。(3)成功建立DPS药效性检测模型,能检测米诺地尔促进DPS中ALP和β-catenin的表达上调。(4)rh FGF5上调DPS中BMP4和Wnt5a表达,下调β-catenin表达从而抑制DPS毛发诱导能力;且在DHT刺激DPS 24 h后其培养基上清处理表皮细胞发现FGF5表达量显著上调。
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