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目的:肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。已有研究证实,肿瘤干细胞(CSCs)在肿瘤发生、转移和复发中起着关键作用。基于CSCs的抗肿瘤疫苗可以特异性清除体内处于休眠状态的CSCs,并防止肿瘤的复发与转移,从而提高肿瘤治愈率。但由于CSCs在肿瘤组织中含量很低,并且分离困难,不易培养,因此CSCs特异性抗原的获取较难,导致其应用受到限制。胚胎干细胞和诱导多能干细胞与肿瘤干细胞均为干细胞,具有相似的干性相关的特异性抗原。本研究提出“利用诱导多能干细胞上的抗原代替肿瘤干细胞抗原来诱导体内特异性免疫从而抑制肿瘤生长”的科学假说,利用hiPSCs联合佐剂CpG制备抗肿瘤干细胞疫苗,观察在人源化肺癌小鼠模型中诱发抗肿瘤干细胞特异性免疫反应的效果,研究其对肿瘤生长的抑制能力,以及对体内抗原提呈细胞的影响,为研制抗肺癌肿瘤干细胞疫苗提供理论基础。方法:肺腺癌A549细胞系用ALDEFLUOR试剂染色,流式细胞术分选出A549-ALDH+细胞,并通过细胞增殖能力、细胞克隆实验和体内成瘤实验等方面验证了其CSCs的特性。利用Illumina Hi Seq X10测序平台进行测序,对A549-CSCs和hiPSCs进行比对分析。hiPSCs联合CpG制成疫苗,并对疫苗进行减毒灭活处理,分别在0、7、14、21天对人源化小鼠进行接种免疫,在28天动物荷瘤。向A549和H1975肺腺癌细胞系中分别加入第一次免疫后第2周和第4周的小鼠血清样本,流式细胞术检测特异性抗体Ig G。荷瘤2周后,利用流式细胞术检测脾脏抗原提呈细胞比例(CD11c+HLA+CD80+、CD11b+CD80+)、细胞毒性T细胞比例(CD8+T细胞)、Treg比值(CD4+CD25+Foxp3+)。荷瘤4周后,流式细胞术检测脾脏T细胞以及外周血T细胞比例,肿瘤组织切片免疫组化染色检测CD8+T细胞,评估hiPSCs作为抗原联合CpG是否可诱导特异性免疫反应,并观察肿瘤生长情况。分离预免疫小鼠CD3+T细胞,注射入荷瘤小鼠体内,监测肿瘤生长,流式细胞术检测毒性T细胞比例(CD8+CD44+T细胞),脾脏T细胞亚群(Th1、Th2、Th17)比例,评估预免疫组小鼠细胞毒性T细胞过继移植能否阻止荷瘤小鼠的肿瘤生长,引起抗肿瘤特异性免疫反应,并研究其作用机制。结果:流式细胞术(FCM)成功分选出A549-CSCs,证明了分离的CSCs具有典型的干细胞特征,测序同时也证实CSCs与iPSCs之间具有类似的基因表达谱。hiPSCs作为抗原免疫小鼠后血清中可检测出抗肿瘤特异性Ig G抗体,且逐渐增加。荷瘤小鼠治疗2周后,与PBS组(0.81%±0.26%、0.78%±0.13%、0.74%±0.15%)相比,iPSCs+CpG组脾脏抗原提呈细胞(1.55%±0.18%、1.11%±0.26%)与CD8+T细胞比例(3.79%±0.31%)显著升高(P<0.05),而Treg细胞比例(1.86%±0.12%)与PBS组(3.04%±0.29%)相比明显下降(P<0.01)。治疗4周后,iPSCs+CpG疫苗免疫组肿瘤体积为69.57 mm~3,明显小于其他各组(P<0.01)。体内结果显示,iPSCs+CpG组小鼠脾脏CD8+T细胞明显增多(11%±3.48%iPSCs+CpG vs.2.98%±0.43%PBS)(P<0.05),外周血T细胞比例(2.89%±0.93%CD8+T细胞,7.5%±3.45%CD4+T细胞)同样高于PBS组(0.78%±0.23%CD8+T细胞,3.64%±1.09%CD4+T细胞)(P<0.05),免疫组化结果显示,iPSCs+CpG组小鼠瘤内CD8+T细胞浸润均较其他组增多。iPSCs+CpG组脾细胞Th1比例升高(19%±1.14%iPSCs+CpG vs.11%±0.57%PBS)(P<0.05),Th17和Treg比例(3.11%±0.55%)较PBS组(5.78%±0.82%)明显降低(P<0.05),且Th2比值无明显变化。从注射iPSCs+CpG小鼠体内分离出T细胞,并将细胞移植到肺癌小鼠体内,发现肿瘤体积明显减小,且iPSCs+CpG组小鼠体内细胞毒性T细胞(12.5%±3.92%)与PBS(2.48%±0.78%)相比明显升高(P<0.01),脾脏Th1亚群(26.67%±3.83%)同样明显高于PBS组(16.2%±1.28%)(P<0.05),而Th17比值(3.53%±1.31%)较PBS组(5.65%±0.89%)降低(P<0.05),脾脏Th2亚群无明显差异(P>0.05)。结论:研究发现人成纤维细胞来源的iPSCs具有与肿瘤干细胞相似的表面抗原,利用hiPSCs结合佐剂CpG作为抗肿瘤疫苗可以在人源化肺癌小鼠模型引起小鼠体内抗肿瘤特异性免疫反应。可以刺激抗原提呈细胞(DC)提呈抗原致敏细胞毒性T细胞,特异性杀伤肿瘤细胞并抑制肿瘤生长。免疫小鼠中脾T细胞过继移植后同样可以在小鼠体内产生特异性免疫反应,杀伤肿瘤细胞减少肿瘤负荷并抑制小鼠体内肿瘤生长,诱发活体内抗肿瘤反应。