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番木瓜环斑型花叶病毒病(papayaringspotvires,PRSV)作为番木瓜生产上的世界性严重病害,已成为番木瓜生产的主要限制因子,抗病育种当前番木瓜育种的最主要目标。本研究通过田间实生选择,成功从岭南种中选育出抗病突变岭抗1号,并通过接种PRSVYs、Vb和Sm等3个株系及田间诱发鉴定,研究了抗PRSV突变体岭抗l号的抗病稳定性;用岭抗1号分别和穗中红及美中红杂交获得的杂交后代接种3个PRSV株系,研究了岭抗1号的抗病性遗传特性;借助RAPD和集群分离分析法(BSA)分析法,进行了与抗病性密切相关的RAPD标记筛选和抗病基因的连锁分析;通过分析体内过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)及超氧化物歧化酶(SOD)酶活性和POD同工酶的变化动态及应用RT-PCR一步法检测PRSV—Ys株系在感病番木瓜及其抗病突变体植株体内的运转动态,分析了岭抗1号的抗病生理特性,取得了如下主要结果:
1、对岭抗1号接种PRSVYs、Vb和Sm3个株系及田间诱发鉴定,结果表明,岭抗1号表现出高抗PRSV-Ys和PRSV-Vb2个株系的能力,对PRSV-Sm株系则无明显抗病能力,抗病性不因自交繁殖而丧失,种植到田间的接种苗成株期的田间抗性表现与苗期表现基本一致,表明岭抗1号的抗病性能具较高的稳定性。花粉染色体表现正常,推断岭抗1号的抗PRSV突变来源于基因突变。
2、对岭抗1号和穗中红及穗中红的杂交后代人工接种PRSVYs、Vb和Sm3个株系进行遗传特性分析,结果表明,F2代对PRSVYs和Vb株系的抗病表现为由一对基因控制的质量性状遗传,抗病为隐性,感病为显性,感抗分离比例为3:1,BCl代感抗分离比例为1:1,表明岭抗1号具对PRSV株系专化性的隐性抗病基因,本文将该隐性抗病基因暂命名为rys基因。Tys是番木瓜栽培种中发现的第一个抗PRSV隐性基因。
3、以岭抗1号和穗中红杂交后代F2代为群体,利用BSA技术建立两个DNA混合池(感病池和抗病池)进行RAPD标记分析,从250个随机引物中筛选出了与抗PRSV基因rys-~因相连锁的3个RAPD标记:S1366、S7958和S7125,并在抗、感池中的个体和池外部分个体上得到验证,鉴定结果符合率达85%以上。引物S7058在700bp处表现出差异明显的带型差异,引物S7125在600bp处表现出差异明显的带型差异,且感病单株有特异带扩增,而抗病单株无特异带扩增;引物S1366在约900bp处表现出差异明显的带型差异,感病单株无特异带扩增,抗病单株有特异带扩增;通过选择性基因型分析法进行标记一性状连锁分析,S7058700、S712500和S1366900与rys基因的遗传距离分别为1.9cM、2.4cM和12.2cM,其中S1366900和S7058700两个标记在rrs基因的一侧,S7125600标记在rys基因的另一侧,这在番木瓜抗PRSV标记与性状连锁分析和育种研究中属首次报道,研究结果为番木瓜抗病育种的MAS奠定了基础。
4、对POD、PPO及SOD酶活性的变化研究结果表明,岭抗l号接种PRSV-Ys株系后POD和PPO活性的变化动态是先升后降,且上升幅度明显高于感病品种穗中红,而到接种后期,POD和PPO活性则低于穗中红;接种PRSV-Ys后岭抗1号的SOD活性在初期升高,后期则恢复到正常水平,感病品种穗中红接种后初期SOD活性上升幅度高于岭抗1号,后期SOD活性下降到低于接种前水平。POD同工酶研究结果表明:岭抗1号接种PRSV-Ys株系后增加1条明显的谱带Rf0.745,而感病品种穗中红则没有,这一特异蛋白带的组成型表达及酶活性的变化显示出与品种抗病的相关性,可作为评价品种抗病性的生理生化指标。
5、应用RT-PCR一步法检测了PRSV—Ys株系在感病品种及抗病类型岭抗1号植株体内的运转动态,结果表明:在感病植株中,接种后24h接种叶的未接种部位可检出病毒,第5d接种叶柄可检出病毒,第10d植株各部位均能检出病毒;而在抗病的岭抗1号植株中,接种后仅能在接种部位检出病毒;表明岭抗1号能够有效阻碍病毒从接种部位运出及向未接种部位运入。