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miRNAs(MicroRNAs)是一类约为22个核苷酸组成的非编码RNAs(Lagos-Quintanaet al.,2001；Lau et al.,2001；Lee and Ambros,2001),其来源于大的初始转录本(pri—miRNA),此初始转录本被加工成70个左右的核苷酸前体(pre-miRNA),再经核酸酶剪切为成熟体(Lee et al.,2002；Bartel,2004；Cullen,2004；He and Hannon,2004)。已发现很多miRNAs普遍存在于多种生物体中,且大都为高度保守,表明miRNAs发挥着重要的作用(Bartel,2004),调控不同的发育阶段和生理过程(Plasterk,2006；Shivdasani,2006)。一些miRNAs在特定的组织,细胞和发育阶段表达,而有些则是组成型表达(Pasquinelli et al.,2005)。因此,研究miRNAs表达的调控机制有助于更好地去了解其生理学功能。
尽管对miRNA的了解日益增长,但对miRNAs的转录调控方面依然知之甚少。然而,不断累积的数据证实多数miRNAs是由RNA聚合酶Ⅱ转录的(Lee et al.,2004),这与miRNAs严格的时空表达一致,从而也推测很多蛋白编码基因的转录因子参与到miRNAs的转录调控中。现在普遍认同的是大部分miRNAs是由它们各自的启动子转录。因此,研究miRNA的转录机制,弄清其基因组调控元件是具有重要的意义。
bantam和miR-276a是果蝇基因间区的2个miRNA,在前期工作中利用RACE技术克隆了果蝇pri-bantam、pri-mir-276a的全长,对其基因结构进行分析,表明pri-miRNA转录本是由polⅡ转录而来。随后,利用非磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ的抗体(anti-PolⅡa,8WG16)进行体内的染色质免疫共沉淀分析(ChromatinImmunoprecipitation assay,CHIP),锚定了bantam和miR-276a的核心启动子,并用双荧光素酶报告基因系统检测到了miRNA基因启动子的活性.进一步利用生物信息学方法预测了miRNA启动子区转录因子结合位点(Transcription Factors Binding Sites)。本课题旨在探索预测的bantam和miR-276a核心启动子区的共有转录因子Mad以及miR-276a独有的Prd和Dorsal对转录活性的影响。使用突变试剂盒对已经验证的有转录活性的启动子区转录因子结合位点进行基因定点突变,采用组合的方式进行单个或多个位点的突变。突变后的miRNA基因启动子的活性通过双荧光素酶报告基因系统来检测。结果显示,突变型的bantam和miR-276a启动子重组载体荧光素酶活性相对于对照组都有明显下降,说明Mad,Prd及Dorsal转录因子结合位点对bantam和miR-276a启动子转录有明显影响,证明了其均是功能位点,参与了miRNA基因的转录调控。并且不同的结合位点对转录活性的影响不同,而这种不同为分化调控提供了基础。