心血管疾病,尤其是心肌缺血引起的大量功能性心肌细胞损伤、死亡以及所导致的心脏疾病,如心衰等,已成为首要威胁人类健康的杀手。对于各种类型的终末期心血管疾病,目前传统的治疗手段仅能延缓病情发展而无法彻底治愈。利用再生医学理论,结合现代的生物医学组织工程技术手段,已经能够在实验室制作出人工组织器官,并且部分研究成果已经用于临床应用。令人极为振奋的是,干细胞能够分化再生成心肌细胞,再结合上组织工程技术,实现体外构建心肌组织将不再是一个梦想。这将为心血管疾病的治疗带来新的希望,因此现在研究的热点集中在这方面。干细胞众所周知的宝贵特性是:自我更新和多向分化。基于干细胞分化而来的心肌细胞,无论成熟或者幼稚,均能够有益于受损的心脏,恢复心脏功能,已成为目前以及未来治疗心血管疾病的新策略。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,i PSC)20世纪初首次报道,科学家费劲周折筛选出一批转录因子,组合排列后导入小鼠皮肤成纤维细胞,最终划时代性地制出了类似于胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)样的多能干细胞。由于i PSC能够从自体细胞逆分化获得,因此避免了伦理学争议及免疫排斥反应等棘手问题,成为当前的热宠。然而,i PS细胞定向诱导分化目前还存在着靶细胞定向分化效率低、分化机制不清、靶细胞功能不够成熟等问题,阻碍了其在心肌组织工程再生中的应用。Micro RNA(mi RNA),研究火热多年,是广泛存在于真核细胞内的一类内源性非编码小RNA,不负责编码蛋白质,却能调节m RNA的翻译。它们的序列高度保守,生物功能广泛多样。它通过降解m RNA抑制蛋白质翻译表达,从而对细胞生长、分化、迁移、凋亡以及组织发育进行调控。大量研究发现,约有40余种micro RNA参与调控心肌生理和病理活动,其中micro RNA-1(mi RNA-1)和micro RNA-133(mi RNA-133)已证实参与了胚胎期心肌生成及发育过程,且已证实mi RNA-1与mi RNA-133在肌组织中高度表达丰富。为此我们推测:mi RNA-1和mi RNA-133可能参与调控i PSC定向分化为心肌细胞的过程,人为调控这一机制有助于促使i PSC更有效地向心肌细胞定向分化。实验目的:研究mi RNA-1与mi RNA-133对mi PSC向心肌细胞自发分化的影响;探讨其参与mi PSC心肌分化的相关作用机制。实验方法:1)采用RT-PCR检测mi PSC未分化阶段、新生乳鼠心肌细胞、mi PSC自发分化过程中0 d、3 d、5 d、10 d各时间点细胞内mi RNA-1和mi RNA-133的表达。2)利用瞬时转染方法对miPSC分别转染mi RNA-1、mi RNA-133载体和二者共转染(mi RNA-1+133),并RT-PCR检测mi RNA-1及mi RNA-133的转染后的表达情况,验证转染有效性。3)转染后细胞自发分化至第15天,检测统计第15天跳动的心肌合胞体数量,并通过RT-PCR及q RT-PCR检测心肌特异性的转录因子NKX2.5的m RNA,特别是心肌细胞特异性c Tn T、α-MHC的m RNA表达水平,并进行统计比较。4)利用免疫化学染色方法,选用特意性的抗体来标记心肌特异性结构蛋白cTnT,用直观的荧光图像来验证mi PSC源性心肌细胞的分化。5)分别添加ERK1/2/MAPK、JNK、FAK、AMPK通路经典抑制剂,q RT-PCR检测分别阻断上通路后心肌标志物表达情况,根据各个抑制剂的效果,筛选高度可疑的信号通路。6)Western blot检测ERK通路蛋白磷酸化水平,比较添加抑制剂前后目标蛋白表达变化和活性状态变化,验证其与c Tn T的关系。实验结果:1)mi PSC在明胶单层培养中干性标志物Oct4和Nanog持续强表达,而未检测到mi RNA-1和mi RNA-133的表达;mi RNA-1和mi RNA-133在小鼠心肌细胞中高表达;自发分化10天,能够在纤维镜下看到跳动的细胞团;在分化的动态时间过程,从第5天开始,检测到NKX2.5和c Tn T的表达,逐渐增多;mi RNA-1和mi RNA-133的表达增长与时间正相关。证实第一:mi PSC单层培养能够自发分化成心肌细胞;第二:mi RNA-1和mi RNA-133的表达随着朝心肌细胞分化不断进行而不断升高。这种密切的关系,强烈提示mi RNA-1/133与i PSC的心肌细胞定向分化密切相关。2)mi PSC瞬时转染mi RNA-1和mi RNA-133,第三天检测RNA表达结果,二者表达均显著升高,显示转染成功,目的分子在细胞内表达显著。3)mi RNA-1与mi RNA-133单独过表达对mi PSC向心肌细胞分化没有显著作用,但二者共转染能够显著增强心肌分化,提示mi RNA-1与mi RNA-133间存在协同作用共同促进心肌分化定向分化。RT-PCR检测心肌特异性标记物Nkx2.5、α-MHC、c Tn T、MLC2a/2v表达水平证实mi PSC向心肌分化显著升高。4)分化结束,心肌特异性蛋白c Tn T染色标记的荧光成像照片显示:mi PSC可在体外自发性分化出跳动的心肌细胞,单独转染过表达mi RNA-1与mi RNA-133对心肌分化无明显影响,但是共转染能够显著增强心肌细胞的分化形成,而且分化形成的心肌细胞肌节呈竹节样形态,结构比较成熟。5)ERK1/2/MAPK、JNK、FAK、AMPK通路抑制筛选发现,只有使用ERK1/2/MAPK通路抑制剂时,才会明显阻断掉mi RNA-1/-133的联合促心肌分化作用。提示mi RNA-1/-133的联合促心肌分化作用可能是通过调节ERK1/2/MAPK通路来实现的。6)Western blot半定量检测发现,mi RNA-1和mi RNA-133联合过表达能够升高mi PSC分化过程中ERK1/2和磷酸化ERK(p-ERK1/2)的表达水平,添加p-ERK1/2抑制剂(PD98059)显著削减p-ERK1/2水平,并高度抑制c Tn T的表达。结论:mi RNA-1与mi RNA-133协同参与iPSC向心肌细胞的定向分化过程,早期同时过表达mi RNA-1/133可促使i PSC定向分化为心肌细胞,该作用是通过上调ERK1/2-MAPK通路中p-ERK1/2的水平来实现的。