miR-203a-5p、miR-205-5p在蕈样肉芽肿的表达及其在Hut-78细胞中生物学功能的研究

来源 :新疆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Richie911
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目的:研究miR-203a-5p和miR-205-5p在蕈样肉芽肿组织、蕈样肉芽肿旁组织、湿疹皮损组织和正常包皮组织中的表达情况差异,通过临床样本验证靶基因,并进一步探讨miRNA在Hut-78细胞中的调控机制。方法:(1)取自2016年01月至2017年05月于新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科就诊,皮损病理诊断明确的红斑期MF患者皮损及皮损旁组织,慢性湿疹皮损组织及正常包皮组织,共分为4组。采用基因检测手段测定4组分组中miR-203a-5p和miR-205-5p的表达水平。(2)micro RNA及靶基因筛选,通过miRWalk2.0、miRBase等公开人类micro RNA基因数据库和文献报道进行micro RNA靶基因筛选。采用基因检测和蛋白检测手段分别检测靶基因E2F1、E2F3、ZEB2、CCNG1的基因和蛋白表达在4个分组中的差异性。(3)体外培养Hut-78细胞,并将miR-203a-5p mimics、miR-203a-5p mimics NC、miR-205-5p mimics、miR-205-5p mimics NC、miR-203a-5p inhibitor、miR-203a-5p inhibitor NC、miR-205-5p inhibitor、miR-205-5p inhibitor NC转染Hut-78细胞,设置正常对照Hut-78细胞组同时进行相关表型实验。本次研究分别采用MTT法检测细胞生长状态,流式细胞术检测细胞凋亡和周期的变化,JC-1法检测细胞的早期凋亡情况,EDU法检测细胞中DNA复制过程中的增殖率变化。(4)体外培养Hut-78细胞,转染该细胞后,采用实时荧光定量PCR法检测miR-203a-5p和miR-205-5p的表达情况,蛋白检测方法测定p53、E2F1、E2F3、MDM2的蛋白表达情况。实验的最终数据分析统一采用SPSS20.0软件评估,P<0.05为差异有统计学意义。结果:(1)miR-205-5p和miR-203a-5p在MF皮损组织中低表达,与MF皮损旁组织、湿疹皮损组织与正常包皮组织之间表达差异明显。miR-203a-5p在湿疹皮损组织中高表达,与MF皮损组织和正常包皮组织之间表达差异明显。(2)E2F1、E2F3、ZEB2、CCNG1在MF皮损组织中高表达,与MF皮损旁组织、湿疹皮损组织与正常包皮组织之间表达差异明显。(3)miR-203a-5p mimics与miR-205-5p mimics显著的降低了Hut-78细胞的增殖活性。miR-203a-5p inhibitor与miR-205-5p inhibitor显著的升高了Hut-78细胞的增殖活性,且都具有时间依赖性;miR-203a-5p mimics组和miR-205-5p mimics组的Hut-78细胞的凋亡率显著升高,miR-203a-5p inhibitor组和miR-205-5p inhibitor组的Hut-78细胞的凋亡率显著降低;miR-203a-5p mimics组和miR-205-5p mimics组对Hut-78细胞的细胞周期调控较为明显,而miR-203a-5p inhibitor组和miR-205-5p inhibitor组对细胞周期无影响;miR-203a-5pa-5p mimics组和miR-205-5p mimics组的Hut-78细胞的前期凋亡率显著升高,miR-203a-5p inhibitor组和miR-205-5p inhibitor组的Hut-78细胞的前期凋亡率显著降低;miR-203a-5p mimics组和miR-205-5p mimics组的Hut-78细胞的DNA合成期增殖率显著降低,而miR-203a-5p inhibitor组和miR-205-5p inhibitor组无影响;miR-203a-5p与miR-205-5p对Hut-78细胞具有一定的调控作用,mimics组的影响较inhibitor组更为明显;miR-203a-5p在对Hut-78细胞的调控作用高于miR-205-5p。miR-203a-5p与miR-205-5p对Hut-78细胞的调控既可以促进细胞的增殖也可以诱导细胞的凋亡,且凋亡率高于增殖率。(4)miR-203a-5p和miR-205-5p mimics组在Hut-78细胞中高表达,miR-203a-5p和miR-205-5p mimics组在Hut-78细胞中低表达;miRNA mimics组抑制E2F1、E2F3、p53的蛋白表达,促进MDM2的表达;miRNA inhibitor组促进E2F1、E2F3、p53的表达啊,抑制MDM2的表达;miRNA mimics组通过介导p53信号通路,促进Hut-78细胞增殖;miRNA的高表达会促进p53诱导的凋亡现象。结论:(1)miR-203a-5p与miR-205-5p在蕈样肉芽肿皮损组织、蕈样肉芽肿皮损旁组织、湿疹皮损组织和正常包皮组织中存在差异表达,这两个micro RNA的靶基因为E2F1、E2F3、ZEB2、CCNG1。(2)miR-203a-5p与miR-205-5p与靶基因之间是负相关关系。(3)miR-203a-5p与miR-205-5p在Hut-78细胞中的高表达会抑制细胞生长、促进细胞凋亡、改变细胞周期、诱导早期凋亡与细胞增殖率,表明对Hut-78细胞的生物学行为起到调控作用。(4)miR-203a-5p与miR-205-5p可以通过调节p53信号通路上游因子与下游因子活性来调控Hut-78细胞的生物学功能。(5)miR-203a-5p与miR-205-5p的低表达可能为蕈样肉芽肿的调控miRNA,可以为目前MF发病机制及早期诊断提供一定的理论依据。
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