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目的以原代脑微血管内皮细胞(BMECs)为研究对象,体外建立内皮细胞氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)模型模拟脑缺血再灌注过程,探讨补阳还五汤及其类方(养阴通脑颗粒、补阳还五汤和脑心通胶囊)对内皮细胞的保护作用;体内通过建立大鼠脑缺血损伤(MCAO)模型,研究补阳还五汤类方促脑微血管生成作用并探讨其可能机制,为缺血性中风的治疗提供了新的方向和思路。方法(1)以SD大鼠为研究对象,建立MCAO模型,将大鼠随机分成5组:假手术组、模型组、养阴通脑颗粒组、补阳还五汤组和脑心通胶囊组。给药7d后观察对各组大鼠进行神经功能评分;HE染色观察脑缺血皮层区域的组织病理变化;TTC染色评估脑梗死体积;实时荧光定量PCR检测MMP-2、HIF-1α、VEGF、Notch1和Hes-1基因mRNA表达水平;免疫组化检测缺血侧脑组织的CD31和VEGF蛋白的表达。(2)原代BMECs的培养和OGD/R模型的建立:选择出生3～5 d的乳鼠进行BMECs分离和培养,纯化内皮细胞后进行鉴定,并建立该细胞的OGD/R模型。(3)将SD大鼠随机分成正常对照组、养阴通脑颗粒组、补阳还五汤组和脑心通胶囊组,连续灌胃给药7 d,腹主动脉采血制备含药血清。CCK-8法确定补阳还五汤类方的含药血清作用于BMECs的最佳药物浓度。(4)以第四代的BMECs为研究对象,设置5个组,分别为正常组、模型组、养阴通脑颗粒组、补阳还五汤组和脑心通胶囊组。划板实验观察细胞迁移情况;鬼笔环肽染色法检测细胞骨架;Hoechst染色观察细胞凋亡情况;qRT-PCR检测Notch1、VEGF和Mmp-2基因的变达;利用免疫印迹Westwen blot检测关键蛋白Notch1的表达。结果(1)与模型组比较,补阳还五汤类方组均能不同程度减轻脑缺血再灌注损伤,减小脑梗死体积,降低脑神经功能评分;补阳还五汤类方均能不同程度增加VEGF蛋白表达,降低MMP-2、Notch1和Hes-1的mRNA表达,其中脑心通组和补阳还五汤对VEGF调控更显著。相对于养阴通脑颗粒,补阳还五汤和脑心通更能增加CD31的表达量,促进微血管的生成。(2)成功培养了高纯度的BMECs,BMECs多为梭形和多角形,单层贴壁生长,细胞之间紧密相接,有“漩涡状”分布,呈典型的“铺路石样”。经氧糖剥夺再灌注后,BMECs形态发生明显改变,出现皱缩,贴壁能力下降,部分细胞脱落或死亡,细胞间隙变大,边界形态不规则,胞质内出现明显空腔。(3)成功制备补阳还五汤类方的含药血清。CCK-8法确定各给药组均选择10%含药清作用于BMECs,以该给药浓度进行后续实验。(4)建立OGD/R模型后,补阳还五汤类方均能不同程度减轻BMECs的损伤,提高细胞存活率,抗细胞凋亡作用,稳定细胞骨架,上调Notch1表达,降低MMP-2基因的表达。相对于补阳还五汤,养阴通脑颗粒和脑心通胶囊的对MMP-2调控作用更为显著。结论脑缺血再灌注损伤后,补阳还五汤类方可能通过促进缺血侧脑组织内的微血管生成,促进缺血半暗带的血流恢复,减低脑损伤,加快神经功能的恢复,其中脑心通胶囊和补阳还五汤的改善作用更为明显,其机制可能与调控HIF-1α/VEGF和Notch1蛋白的表达有关。