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目的：
蛋白质的泛素化是一种重要的的翻译后修饰，可参与大部分的生物学功能，帕金森相关基因PARK2可编码E3泛素化连接酶，有研究显示PARK2是一个潜在的肿瘤抑制因子，我们之前的研究表明在肺癌细胞中PARK2与糖代谢有关，但其具体作用机制尚不清楚。有氧糖酵解的增加是肿瘤细胞重要的标志，肿瘤细胞可以通过有氧糖酵解途径提供其所需的能量和代谢合成所需的原料，有氧糖酵解导致的乳酸生成增加会促进肿瘤的转移。近年来越来越多的研究关注于代谢异常和肿瘤发生发展的关系。当前尚无有关乳腺癌中PARK2基因与有氧糖酵解的关系及其可能机制的相关研究报道。基于以上原因,本论文拟研究PARK2与乳腺癌中糖代谢异常的关系以及作用机制，同时研究PARK2能否通过糖代谢途径来调控乳腺癌细胞的增殖。以此为依据,用CRISPR/Cas9技术构建PARK2稳定敲除MCF7乳腺癌细胞系以及稳转过表达PARK2MCF7细胞株，通过体外实验观察PARK2对乳腺癌细胞中糖代谢的影响，深入探讨PARK2基因对乳腺癌细胞MCF7生物学行为的影响和可能的调控机制，并进一步探讨PARK2对乳腺癌代谢重编排的作用与缺氧诱导因子HIF1A的相关性。本文揭示了PARK2在癌细胞中的生物学功能，阐明其分子机制并揭示临床研究意义。
方法：
1.利用CRISPR/Cas9技术，构建重组质粒pSpCas9(BB)-2A-GFP-PARK2sgRNA,利用转染技术通过脂质体将质粒转入乳腺癌细胞MCF7中，将GFP阳性细胞进行分选，通过PCR电泳测序以及Westernblot验证敲除的细胞株，构建PARK2稳定敲除的MCF7稳定细胞株。
2．用葡萄糖摄取实验、乳酸生成实验检测乳腺癌细胞中PARK2高表达、低表达与空载对照组中有氧糖酵解的区别。
3.采用实时荧光定量PCR、Westernblot检测细胞HIF1A、Actin的蛋白表达水平表达，以及HIF1A信号通路中下游因子LDHA、GLUT1的基因和蛋白表达情况。
4.在PARK2高表达、低表达MCF7细胞株中敲减HIF1A,用葡萄糖摄取实验、乳酸生成实验检测葡萄糖摄取和乳酸生成的变化。
5.生物信息学分析数据库TCGA中乳腺癌组织及癌旁组织PARK2的表达，MTT实验验证PARK2对MCF7细胞增殖的影响，经糖酵解抑制剂2-DG处理后检测细胞生长曲线，观察PARK2能否通过糖代谢途径来调控乳腺癌细胞的增殖。
6.分析临床上乳腺癌患者PARK2和LDHA、GLUT1表达的相关性，乳腺癌患者LDHA、GLUT1表达的预后分析。
结果：
1.成功构建出含有相应sgRNA的载体，成功获得筛选细胞，PCR电泳及测序结果显示PARK2稳定敲除细胞株1缺失50个核苷酸，PARK2稳定敲除细胞株2缺失67个核苷酸，Westernblot结果显示PARK2稳定敲除细胞株PARK2蛋白几乎未见表达。
2.葡萄糖摄取实验、乳酸生成实验显示PARK2低表达组与空载对照组相比，葡萄糖摄取和乳酸生成增加，PARK2过表达组与空载对照组相比，葡萄糖摄取和乳酸生成降低。
3.HIF1A下游靶基因LDHA、GLUT1在PARK2过表达组中与空载对照组对比基因和蛋白水平均降低，在PARK2低表达组中与空载对照组对比基因和蛋白水平均增高。且在过表达和低表达PARK2细胞系中敲减HIF1A后PARK2对LDHA、GLUT1表达水平几乎无影响。
4.在过表达和低表达PARK2细胞系中敲减HIF1A后,葡萄糖摄取实验、乳酸生成实验显示PARK2低表达组与对照组相比，葡萄糖摄取和乳酸生成无明显变化，PARK2过表达组与对照组相比，葡萄糖摄取和乳酸生成无明显变化。
5.乳腺癌患者肿瘤组织与癌旁组织对比PARK2表达量降低，MTT结果表明PARK2过表达抑制MCF7乳腺癌细胞增殖,PARK2低表达组与空载对照组相比前者乳腺癌细胞增殖加快。用糖酵解抑制剂2-DG处理过表达和低表达PARK2细胞与空载对照组细胞，增殖能力均明显降低，且过表达和低表达PARK2细胞与空载对照组细胞生长差距较未经2-DG处理的明显减小。
6.临床数据表明乳腺癌患者PARK2和LDHA、GLUT1表达具有显著相关性，且乳腺癌患者LDHA、GLUT1高表达患者预后不好。
结论：
本实验成功构建了PARK2稳定敲除以及PARK2过表达乳腺癌MCF7细胞株。分析了PARK2不同表达水平对肿瘤细胞代谢的影响，尤其是PARK2对肿瘤细胞中糖酵解产物的影响以及关键酶表达的变化。PARK2过表达可抑制乳腺癌细胞MCF7中的糖酵解途径，从而抑制肿瘤的增殖，PARK2低表达可促进乳腺癌细胞MCF7糖酵解，进而促进肿瘤细胞增殖。PARK2降低HIF1A蛋白以及其转录活性，导致HIF1A下游糖酵解通路相关靶基因变化，说明PARK2可能通过HIF1A调节乳腺癌的代谢重编排，促进肿瘤的发展。临床数据显示LDHA、GLUT1水平增高预后不佳。综上所述，PARK2在乳腺癌的代谢重编排中具有重要作用，其作用机制可能是通过HIF1A通路调节编码葡萄糖转运蛋白和糖酵解相关酶基因来改变肿瘤代谢，揭示了PARK2抑癌作用的新机制，进一步完善乳腺癌发生的分子机制，提供临床治疗新靶点。
蛋白质的泛素化是一种重要的的翻译后修饰，可参与大部分的生物学功能，帕金森相关基因PARK2可编码E3泛素化连接酶，有研究显示PARK2是一个潜在的肿瘤抑制因子，我们之前的研究表明在肺癌细胞中PARK2与糖代谢有关，但其具体作用机制尚不清楚。有氧糖酵解的增加是肿瘤细胞重要的标志，肿瘤细胞可以通过有氧糖酵解途径提供其所需的能量和代谢合成所需的原料，有氧糖酵解导致的乳酸生成增加会促进肿瘤的转移。近年来越来越多的研究关注于代谢异常和肿瘤发生发展的关系。当前尚无有关乳腺癌中PARK2基因与有氧糖酵解的关系及其可能机制的相关研究报道。基于以上原因,本论文拟研究PARK2与乳腺癌中糖代谢异常的关系以及作用机制，同时研究PARK2能否通过糖代谢途径来调控乳腺癌细胞的增殖。以此为依据,用CRISPR/Cas9技术构建PARK2稳定敲除MCF7乳腺癌细胞系以及稳转过表达PARK2MCF7细胞株，通过体外实验观察PARK2对乳腺癌细胞中糖代谢的影响，深入探讨PARK2基因对乳腺癌细胞MCF7生物学行为的影响和可能的调控机制，并进一步探讨PARK2对乳腺癌代谢重编排的作用与缺氧诱导因子HIF1A的相关性。本文揭示了PARK2在癌细胞中的生物学功能，阐明其分子机制并揭示临床研究意义。
方法：
1.利用CRISPR/Cas9技术，构建重组质粒pSpCas9(BB)-2A-GFP-PARK2sgRNA,利用转染技术通过脂质体将质粒转入乳腺癌细胞MCF7中，将GFP阳性细胞进行分选，通过PCR电泳测序以及Westernblot验证敲除的细胞株，构建PARK2稳定敲除的MCF7稳定细胞株。
2．用葡萄糖摄取实验、乳酸生成实验检测乳腺癌细胞中PARK2高表达、低表达与空载对照组中有氧糖酵解的区别。
3.采用实时荧光定量PCR、Westernblot检测细胞HIF1A、Actin的蛋白表达水平表达，以及HIF1A信号通路中下游因子LDHA、GLUT1的基因和蛋白表达情况。
4.在PARK2高表达、低表达MCF7细胞株中敲减HIF1A,用葡萄糖摄取实验、乳酸生成实验检测葡萄糖摄取和乳酸生成的变化。
5.生物信息学分析数据库TCGA中乳腺癌组织及癌旁组织PARK2的表达，MTT实验验证PARK2对MCF7细胞增殖的影响，经糖酵解抑制剂2-DG处理后检测细胞生长曲线，观察PARK2能否通过糖代谢途径来调控乳腺癌细胞的增殖。
6.分析临床上乳腺癌患者PARK2和LDHA、GLUT1表达的相关性，乳腺癌患者LDHA、GLUT1表达的预后分析。
结果：
1.成功构建出含有相应sgRNA的载体，成功获得筛选细胞，PCR电泳及测序结果显示PARK2稳定敲除细胞株1缺失50个核苷酸，PARK2稳定敲除细胞株2缺失67个核苷酸，Westernblot结果显示PARK2稳定敲除细胞株PARK2蛋白几乎未见表达。
2.葡萄糖摄取实验、乳酸生成实验显示PARK2低表达组与空载对照组相比，葡萄糖摄取和乳酸生成增加，PARK2过表达组与空载对照组相比，葡萄糖摄取和乳酸生成降低。
3.HIF1A下游靶基因LDHA、GLUT1在PARK2过表达组中与空载对照组对比基因和蛋白水平均降低，在PARK2低表达组中与空载对照组对比基因和蛋白水平均增高。且在过表达和低表达PARK2细胞系中敲减HIF1A后PARK2对LDHA、GLUT1表达水平几乎无影响。
4.在过表达和低表达PARK2细胞系中敲减HIF1A后,葡萄糖摄取实验、乳酸生成实验显示PARK2低表达组与对照组相比，葡萄糖摄取和乳酸生成无明显变化，PARK2过表达组与对照组相比，葡萄糖摄取和乳酸生成无明显变化。
5.乳腺癌患者肿瘤组织与癌旁组织对比PARK2表达量降低，MTT结果表明PARK2过表达抑制MCF7乳腺癌细胞增殖,PARK2低表达组与空载对照组相比前者乳腺癌细胞增殖加快。用糖酵解抑制剂2-DG处理过表达和低表达PARK2细胞与空载对照组细胞，增殖能力均明显降低，且过表达和低表达PARK2细胞与空载对照组细胞生长差距较未经2-DG处理的明显减小。
6.临床数据表明乳腺癌患者PARK2和LDHA、GLUT1表达具有显著相关性，且乳腺癌患者LDHA、GLUT1高表达患者预后不好。
结论：
本实验成功构建了PARK2稳定敲除以及PARK2过表达乳腺癌MCF7细胞株。分析了PARK2不同表达水平对肿瘤细胞代谢的影响，尤其是PARK2对肿瘤细胞中糖酵解产物的影响以及关键酶表达的变化。PARK2过表达可抑制乳腺癌细胞MCF7中的糖酵解途径，从而抑制肿瘤的增殖，PARK2低表达可促进乳腺癌细胞MCF7糖酵解，进而促进肿瘤细胞增殖。PARK2降低HIF1A蛋白以及其转录活性，导致HIF1A下游糖酵解通路相关靶基因变化，说明PARK2可能通过HIF1A调节乳腺癌的代谢重编排，促进肿瘤的发展。临床数据显示LDHA、GLUT1水平增高预后不佳。综上所述，PARK2在乳腺癌的代谢重编排中具有重要作用，其作用机制可能是通过HIF1A通路调节编码葡萄糖转运蛋白和糖酵解相关酶基因来改变肿瘤代谢，揭示了PARK2抑癌作用的新机制，进一步完善乳腺癌发生的分子机制，提供临床治疗新靶点。