节肢动物门(Arthropoda)是动物界最大的一门,全世界现存的120多万种节肢动物,占现生动物种数80%以上。许多节肢动物利用独特的毒液(唾液)系统成功捕食。棒络新妇蜘蛛(Nephaila clavat),属蛛形纲、蜘蛛目、肖蛸科、络新妇属,广泛分布于世界许多地区,我国的多个省份均有分布,主要捕食昆虫,对哺乳动物没有明显毒性。前人对棒络新妇蜘蛛毒液活性资源开发主要关注其中的多胺类的化合物,目前还未见有关棒络新妇毒液中活性多肽成分的报道。由于多肽类生物杀虫剂比化学杀虫剂更高效更安全,开发棒络新妇蜘蛛毒液杀虫多肽资源可以拓展生物杀虫剂的资源库。蜱虫是是蚊子以外的第二大疾病传播媒介,以吸血为生,能够短暂寄生在脊椎动物体表,在吸血过程中能够传播多种病原体。肩突硬蜱(Ixodes Scapularis)比其他吸血节肢动物的吸血时间都要长,需要数天才能完全吸饱。它的唾液中含有多种活性分子,能够在长时间吸血过程中抵抗宿主的凝血和免疫反应。蜱虫唾液中的活性蛋白通常只在吸血过程中才被大量诱导表达,在抵抗宿主的免疫反应保证吸血过程顺利完成的同时,也为蜱媒病原体的传播提供了有利时机。伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdoferi sensu lato)又名莱姆病螺旋体,是蜱传莱姆病的病原体,具有独特的结构和超强的运动能力。由于伯氏疏螺旋体抗原的高变异特性,莱姆病至今没有有效的疫苗被开发出来。深入理解病原体—蜱媒介—宿主三者之间的关系,进一步搞清楚伯氏疏螺旋体从媒介到宿主传播的分子机制,将为莱姆病的防治提供重要的理论依据。本文发现了两个分别来自蛛形纲的棒络新妇蜘蛛和肩突硬蜱的活性多肽,依据对这两种有毒节肢动物生存策略的理解,对这两个活性多肽的功能进行了实验研究,以进一步阐明它们的毒液系统在捕食过程中发挥作用的机制,并筛选有应用潜力的活性多肽前体分子。本文的实验部分首先对棒络新妇蜘蛛毒液中的多肽组分进行分离纯化,并选择美洲大蠊测定蜘蛛毒液及分离纯化后各组分的的昆虫毒性。在对棒络新妇蜘蛛粗毒进行初分后,将杀虫活性较高的组分进行进一步分离纯化,通过继续跟踪的杀虫活性,从中分离得到了 一个具有较强杀虫活性的多肽毒素μ-NPTX-Nc1a,纯化得到的Nc1a样品对美洲大蠊的半致死剂量可达135 pmol/g。在蛋白测序得到Nc1a的多肽序列信息后,根据蛋白序列设计引物来扩增棒络新妇蜘蛛毒腺cDNA文库,通过测序及比对得到了 Nc1a的cDNA全序列,并利用质谱和二级质谱分析鉴定其分子量和序列。将蜘蛛毒液注射美洲大蠊时,能够观察到快速的麻痹、致死现象,可推测毒液可能作用于昆虫的神经系统。接下来通过急性分离美洲大蠊DUM神经元,发现Nc1a能够抑制美洲大蠊DUM神经元的钠电流57%±5.5%和钾电流24.6%±6.8%,这种作用方式能够快速导致昆虫麻痹与死亡。同时,Nc1a和棒络新妇蜘蛛毒液对大鼠DRG神经元电压门控离子通道和人酸敏感离子通道均没有作用。综上,本文从棒络新妇蜘蛛毒液中发现的多肽Nc1a可特异性作用于昆虫的电压门控离子通道,是一个安全的有开发应用潜力的生物杀虫剂前体分子。本文实验部分继续对另一有毒节肢动物肩突硬蜱唾液腺来源的和吸血密切相关的蛋白Salp19做了深入研究。实验中,首先通过检测吸血后不同时间点肩突硬蜱的组织,确认了 Salp19在肩突硬蜱吸血前后有显著的表达差异。接下来,通过原核表达获得了Salp19样品,利用蛋白芯片筛选Salp19可能作用的靶点是淋巴毒素受体。淋巴毒素受体(Lymphotoxin beta receptor,LTβR)属于肿瘤坏死因子受体超家族,广泛表达于除T淋巴细胞和B淋巴细胞之外的细胞膜表面,它的多聚化对信号传递是必须的。接下来本文通过ELISA、表面等离子共振和western blot等多种方法确认了 Salp19可以结合并抑制淋巴毒素受体的多聚化。通过人外周血分离的单核细胞PBMC在体外模拟了伯氏疏螺旋体的感染过程,并检测了 Slap19对螺旋体感染所激活的经典和非经典N F-κB信号通路的作用,发现Slap19对非经典NF-κB信号通路的抑制更加明显,并能够显著抑制Th17细胞特异细胞因子的分泌。本文还检测了 Salp19对伯氏疏螺旋体刺激THP-1诱导的巨噬细胞产生的细胞因子的作用,其中对IL-1β和GM-CSF均有显著抑制作用。体内实验中,本文选择了 4周左右的Ba1b/c小鼠品系和B.burgdorferi B31-A3野生型菌株作为实验对象,检测了不同剂量的Salp19蛋白对莱姆病小鼠模型中伯氏疏螺旋体感染的作用。定量PCR和western blot的检测结果表明在脾脏和关节这两个螺旋体易感部位均存在显著增强的螺旋体感染。通过ELISA和小鼠细胞因子芯片同时检测了多个小鼠炎症因子和趋化因子的表达。结果显示,在感染初期Salp19能够显著抑制莱姆病小鼠血清中IL-6、IL-8、CXCL13、GCSF、MIP-1a、CCL5等细胞因子和趋化因子的表达。由于淋巴毒素受体与树突状细胞的成熟及淋巴细胞的分化有关,为了进一步探索和补充Salp19促进伯氏疏螺旋体感染的机制,我们通过流式细胞技术检测了 Salp19对小鼠感染伯氏疏螺旋体初期脾脏和淋巴结免疫细胞的变化。本文发现,在小鼠感染伯氏疏螺旋体初期,Salp19显著抑制DC细胞的成熟和Th17细胞的分化。同时Salp19还能够抑制脾脏B细胞增殖和降低中性粒细胞的数量。本文通过一系列实验系统阐述了从两种有毒节肢动物中鉴定得到的两个蛋白在其捕食过程中发挥的作用,两个蛋白均有很大的应用潜力。Nc1a对美洲大蠊的半致死剂量只需135 pmol/g,能够同时作用与大蠊DUM钠电流和钾电流,适合作为新型的安全生物杀虫剂的前体分子开发。来源于蜱虫唾液腺的蛋白Salp19可作用于淋巴毒素受体起到免疫抑制的作用促进伯氏疏螺旋体的感染,不仅可以用于开发莱姆病的疫苗,也可作为免疫抑制药物前体开发,用于自身免疫疾病和抗免疫排斥的治疗。同时,本文研究两个蛋白结构与功能的思路,可以为开发其他动物天然活性资源提供借鉴。