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非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是代谢综合症的肝脏并发症,NAFLD从非酒精性脂肪肝(NAFL)到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的连续肝异常,其病程可变,最终可能导致肝硬化和肝癌。随着NAFLD对世界卫生的影响越来越大,研究人员对NAFL及其NASH进行了更深入的研究。据统计,在2019年,NAFLD影响全球约25%的成年人口。这种疾病患病率的上升增加经济负担,并伴有越来越多的非酒精性肝炎和肝硬化患者以及肝细胞癌的显著增加。与体重指数(BMI)匹配的男性相比,绝经前的女性免受肥胖导致肝脏代谢并发症的影响。这种保护作用可能与雌激素限制肝脏脂肪堆积的能力有关。芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor;AhR)是NAFLD的新型调节剂,可能是调节雌激素稳态和通路的重要靶标。最新研究方向表明激活AhR途径参与非酒精性脂肪肝病程的发展。在本研究中,我们使用苯并芘(BaP)(一种经典且有效的AhR配体)来激活AhR途径,并影响雌激素信号通路中参与肝脂质调节过程中重要基因的表达。AhR的脂肪变性作用可能是由于17β-雌二醇(E2)代谢酶CYP1A1的过表达引起机体雌激素稳态发生改变,也有可能是破坏雌激素信号传导途径中雌激素受体α从而影响NAFLD的发病机制。本研究分两部分实验,主要从体内和体外两方面探讨激活AhR在NAFLD发病中的作用以及基于雌激素信号传导途径的相关机制研究。这项研究的结果可能有助于将AhR建立为脂肪肝疾病的新型治疗和预防靶标。1.CYP450 1A1酶的AhR依赖性诱导抑制雌激素在非酒精性脂肪肝疾病中的作用目的:通过查阅文献和对文献的分析,该实验的第一部分是通过体内和体外实验研究依赖于AhR的CYP450 1A1酶诱导抑制雌激素对非酒精性脂肪肝疾病发展的影响。方法:体内实验:高脂饮食诱导的C57BL/6雌性小鼠NAFLD模型为研究对象。首先研究雌激素在非酒精性脂肪肝病中作用,采取对雌性小鼠进行了双侧卵巢切除(OVX)模拟雌激素缺乏状态下NAFLD的病程变化,同时采用17β-雌二醇给药(即OVX皮下植入E2持续释放),验证E2在NAFLD中的作用。其次我们使用苯并芘(BaP)在高脂饮食的状态下来激活AhR途径以探讨影响体内雌激素参与肝脏脂质调节的过程。体外实验:在体外肝细胞脂肪变性模型中诱导过多的脂质蓄积,采用油酸(Oleic acids,OA)处理人肝癌细胞(HepG2细胞)作为NAFLD的体外细胞模型。在本实验中,首先将含有E2的牛血清白蛋白溶液(1μM)添加到E2处理组,验证雌二醇在体外NAFLD中具有降低脂质蓄积,改善肝细胞脂肪变性的作用。其次将BaP(5μM)溶液添加到另一个E2处理组中,观察AhR激活是否抑制E2对体外肝细胞脂肪变性的影响。结果:AhR激活诱导下游靶基因CYP1A1的过表达,并抑制17β-雌二醇对肝脏脂肪变性的保护作用,其特征在于甘油三酯的积累,肝损伤标志物ALT、AST明显升高。与对照组相比,参与肝脂质代谢中脂肪形成基因固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)的表达增加。此外,涉及脂肪酸氧化的过氧化物酶体增殖物激活的受体α(PPARα)的mRNA和蛋白水平显著降低。结论:我们研究结果表明,AhR的脂肪变性作用是由于E2代谢酶CYP1A1的过表达引起的,该酶降低雌激素的水平,导致脂肪酸氧化的抑制,肝甘油三酯输出的抑制。这项研究结果有助于将AhR建立为脂肪肝疾病的新型治疗和预防靶标。2.AhR介导的ERα表达在非酒精性脂肪肝疾病中的作用目的:该实验的第二部分是通过体内和体外实验验证AhR激活降低ERα表达在非酒精性脂肪肝疾病中的影响。方法:体内实验:我们仍使用苯并芘(BaP)来激活AhR途径,并研究了AhR途径激活对雌鼠肝脏中雌激素受体α的影响,是否破坏了参与非酒精性脂肪肝病的雌激素信号通路。将小鼠分为以下4个组(n=10/组):(1)LFD组,低脂饮食的小鼠;(2)LFD-BaP组,含有BaP(12.5mg/kg/天)的低脂饮食小鼠;(3)HFD组,高脂饮食的小鼠;(4)HFD-BaP,含有BaP(12.5mg/kg/天)的高脂饮食小鼠。为了确定AhR途径是否可以在肝脏中激活,我们在暴露于BaP之后检查了AhR途径的经典靶基因CYP1A1的表达。RT-PCR和western blot分析各组中能够调控脂肪酸,甘油三酯合成以及糖代谢相关酶基因表达的SREBP-1c的mRNA和蛋白表达的变化。同时检测肝脏中雌激素受体α蛋白表达量和mRNA水平。体外实验:采用RT-PCR和western blot分析人肝癌细胞(HepG2)中暴露于BaP检测CYP1A1和ERα的表达。同时,在油酸处理的Hep G2中形成体外非酒精性脂肪肝堆积模型,分别暴露于BaP和E2中以及共同暴露于BaP和E2中,探讨AhR-ERα途径在体外非酒精性脂肪肝中作用。结果:AhR途径激活减少肝脏和HepG2细胞中ERα蛋白水平并破坏雌激素信号传导途径,从而促进雌鼠肝脏和HepG2细胞中脂质的积累。我们的结果提供了对AhR-ERα途径的机制和功能及其对NAFLD进展的影响的见解。结论:AhR激活诱导脂肪变性作用另一个机制是雌激素受体α水平显著降低,阻断了雌激素信号途径。导致脂肪酸氧化的抑制,肝甘油三酸酯输出的抑制。这项研究的结果更进一步解释AhR-ERα途径参与非酒精性脂肪肝病的发展。