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猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）是一种以猪繁殖障碍和呼吸疾病为特征的病毒性传染病,是目前造成全球养猪业巨大经济损失的重要传染病之一。该病由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起。PRRSV以高变性、免疫抑制、持续性感染及抗体依赖性增强为特征,现有疫苗的群体保护力较低,尚无有效的抗病毒药物。PRRSV非结构蛋白Nsp9是RNA依赖的RNA聚合酶,在不同毒株间高度保守,被认为是抗PRRSV药物的一个重要靶标。在先前的研究中,本实验室成功制备出一株PRRSV Nsp9特异性纳米抗体Nb6,并且证明细胞内表达的Nb6可以显著抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制。然而,由于纳米抗体不能有效穿过细胞膜,因此不能进入细胞达到抗病毒的作用。因此,制备安全、有效和无细胞毒性的细胞内递送系统对于提高Nb6的抗病毒活性至关重要。细胞穿透肽（cell penetrating peptides,CPPs）是一类含有约5-30个氨基酸的短肽,可以通过直接易位或内吞作用等方式进入细胞内,且不会引起细胞毒性。目前,CPPs已经被用作向细胞内递送各种货物的工具,例如质粒DNA,siRNA,蛋白质,病毒,成像剂和其他各种纳米颗粒等。TAT蛋白（HIV-1 trans-activator）是人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）反式激活因子,是最早被报道的CPPs。目前已有关于TAT与纳米抗体融合蛋白在癌症治疗中的研究报道,结果表明其具有显著的抗癌效果,并有望被开发为新型抗癌药物。然而,关于CPPs在PRRSV防控中的应用尚未有研究报道。基于以上背景,本研究利用原核表达系统成功表达TAT-Nb6融合蛋白,对其穿膜及抗PRRSV功能进行验证,并对Nb6的抗病毒机制进行初步探索,为抗PRRSV纳米抗体药物的研发提供一定的理论基础。主要研究内容及结果如下:1.细胞穿膜肽TAT介导纳米抗体穿膜的研究本研究首先利用原核表达表达系统获得TAT-Nb6融合蛋白。通过Overlap PCR扩增获得TAT-Nb6基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-21b中,构建pET-21b-TAT-Nb6重组表达质粒。该重组质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞中,IPTG诱导后,获得以包涵体形式表达的TAT-Nb6融合蛋白。经Ni-NTA亲和层析柱纯化、复性和浓缩得到高纯度的TAT-Nb6,并通过ELISA方法验证了TAT-Nb6与PRRSV Nsp9重组蛋白具有很强的结合力。然后将TAT-Nb6分别加入到MARC-145细胞和PAMs细胞的培养基中,与细胞进行共孵育,并利用Western blot、间接免疫荧光和流式细胞术检测两种细胞内TAT-Nb6的量。实验结果表明,TAT能够介导纳米抗体Nb6进入两种细胞,并且呈时间和剂量依赖性。随后对细胞活性进行检测,发现TAT-Nb6浓度≤30μM时对两种细胞均没有细胞毒性。我们进一步验证了TAT-Nb6在猪体内的穿膜能力,免疫组织化学实验结果表明,TAT-Nb6在所有的收集的组织中都有分布。本部分研究结果表明,原核表达的TAT-Nb6融合蛋白不仅可以与PRRSV Nsp9重组蛋白发生互作,同时具有进入细胞的能力。2.TAT-Nb6抗PRRSV的研究本研究通过病毒感染实验来研究TAT-Nb6的抗PRRSV功能。结果表明,TAT-Nb6可以抑制PRRSV基因1型（GZ11-G1）与2型（SD16、JX-A1、GD-HD、VR-2332）毒株在MARC-145细胞系或原代PAM细胞上的增殖,并且呈剂量依赖性。同时发现TAT-Nb6对PRRSV的抑制效果在不同毒株间存在差异。为了初步探索Nb6抗PRRSV的机制,我们利用酵母双杂交技术寻找Nb6与Nsp9的结合区域。结果表明,Nb6与Nsp9互作位点位于Nsp9羧基端的两个不连续区域:Nsp9aa454-551和Nsp9aa599-646。进一步对Nsp9 aa 454-646氨基酸同源性进行分析,结果发现基因1型不同毒株间同源性达到92.2%-100%,2型毒株间达到92.7%-100%,而两种基因型之间同源性只有77.7-81.3%。综上所述,本研究成功表达了TAT-Nb6融合蛋白,该蛋白能够进入到PRRSV感染的细胞内,并发挥抗病毒作用,具有开发为抗PRRSV新型药物的潜力。同时对Nb6抗PRRSV的机制进行初步探索,为抗PRRSV纳米抗体药物的研发提供一定的理论基础。