目的:肾细胞癌（Renal cell carcinoma,RCC）是成人常见的泌尿系统恶性肿瘤,在泌尿系恶性肿瘤中,其发病率仅次于膀胱癌和前列腺癌,约为2%-3%左右。最新的流行病学调查数据显示,大多数国家和地区,肾细胞的发病率都呈快速增长趋势。透明细胞肾细胞癌（clear cell Renal cell carcinoma,cc RCC）是所有肾细胞癌中最常见的类型,占全部肾细胞癌的70%以上。早期肾透明细胞癌的主要治疗方式是手术治疗,保留肾单位手术及肾部分切除术是最常应用的两种术式。但对于合并进展性及转移性肾细胞癌的患者来说,由于患者不适合手术治疗,所以多采用基于内科的综合治疗策略。虽然靶向治疗可以明显改善患者预后,但仍然有部分患者经过长期治疗后无法获得临床疗效。因此,有必要阐明肾透明细胞癌发生发展的分子机制,以发现新的预后标志物和开发新的靶向治疗药物。既往研究已经表明,细胞内琥珀酸脱氢酶（SDH）功能的缺失可促进肿瘤的生长。SDH是线粒体呼吸链和Krebs循环的重要组成部分,已有多项研究表明SDH的遗传缺陷与多种肿瘤相关,包括家族性头颈部副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、胃肠道间质细胞瘤、肾癌等。琥珀酸脱氢酶（SDH）的功能缺失,已被证明在肿瘤细胞生物学功能的调控过程中发挥着重要的作用。既往研究已经发现琥珀酸脱氢酶亚单位A（SDHA）在肾细胞癌组织中低表达,同时SDH缺陷的肾细胞癌具有高侵袭性和高程度恶化的生物学特点。但是有关SDHA完整的,在肾细胞癌的调控作用的研究却罕有报道。以此为契机,我们检测了SDHA在肾癌组织及肾癌细胞系中的表达水平,探讨了SDHA在肾细胞癌中的详细作用机制,为肾细胞癌的诊治提供新的思路和潜在靶点。研究方法:1.样本收集1.1肾细胞癌组织样本收集本研究中涉及到的收集肾癌患者术后病理组织标本的相关操作获得了中国医科大学附属第一医院医学伦理委员会的批准和认可,同时所有肾癌患者在接受手术前均签署了科研知情同意书。我们共收集了84对肾癌组织及与之对应的癌旁正常肾组织,癌旁正常肾组织距离肿瘤边缘大于2cm,切取后的标本组织做适当标记后置于-80℃冰箱中保存,以备后续实验时取用用。患者术前经腹部增强CT、腹部磁共振及泌尿系超声检查确诊,所有肾癌患者在接受手术前均未接受过任何治疗,所有收集到的肾癌组织标本,最后经病理诊断均为肾透明细胞癌。1.2细胞培养本研究培养了OSRC、769-P、ACHN肾癌细胞系,及人肾近端小管上皮细胞系（HK-2）。上述细胞系由中国医科大学附属第一医院泌尿外科研究所提供。2.研究方法2.1检测SDHA在肾细胞癌组织中及肾癌细胞系中的表达水平通过TCGA数据库检索并提取肾透明细胞癌相关数据,分析肾透明细胞癌组织中SDHA m RNA的表达差异。提取肾癌组织及癌旁正常肾组织的总RNA及蛋白,利用q PCR技术及western blot技术检测组织中SDHA m RNA及其蛋白表达水平。培养各肾癌细胞系及永生化正常肾小管上皮细胞系,分别提取各自总RNA和蛋白,并检测SDHA蛋白及m RNA的表达差异。2.2分析SDHA蛋白的临床意义通过检索TCGA数据库,分析SDHA表达差异对肾癌患者预后的影响,免疫组化检测肾透明细胞癌组织中SDHA的原位表达情况。2.3细胞水平检测SDHA对肾癌细胞生物学行为的影响构建SDHA过表达质粒,转染并筛选稳定过表达SDHA的细胞系,通过CCK8细胞增殖实验及Brd U实验检测细胞的增殖能力变化,通过Transwell实验及划痕愈合实验检测细胞的侵袭及迁移能力变化。2.4 SDHA通过调节Wnt/β-catenin信号通路调控肾癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的验证通过western blot实验检测过表达SDHA对肾癌细胞内wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白表达水平变化的影响。通过设计western blot回复实验证明SDHA对肾癌细胞内wnt/β-catenin信号通路的调控作用;通过设计增殖、Transwell及划痕愈合回复实验进一步验证SDHA通过调节Wnt/β-catenin信号通路调控肾癌细胞增殖、侵袭及迁移能力。2.5通过裸鼠成瘤实验进一步在体内验证SDHA对肾癌细胞的生物学影响进行裸鼠成瘤实验,在裸鼠皮下注射过表达SDHA的786-O细胞,观察移植瘤的生长情况,并与对照组移植瘤对比进行统计分析。提取移植瘤组织总蛋白,利用western blot技术检测移植瘤组织中PCNA、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9的蛋白表达水平以进一步在体内验证SDHA对肾癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果:1.肾细胞癌组织及肾癌细胞系中SDHA的表达表达分析采用Real-time PCR和Western-Blot方法分析检测了SDHA的m RNA和蛋白在肾癌组织和癌旁正常组织中的表达水平,同时也检测了SDHA m RNA及蛋白在肾癌细胞系中及肾小管上皮细胞系中的表达水平。结果显示,相比较癌旁正常肾组织,及正常肾小管上皮细胞,SDHA的m RNA水平和蛋白水平在肾癌组织中及肾癌细胞系中均呈低表达,差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫组化结果也提示,对比癌旁正常组织,在肾细胞癌组织中SDHA表达量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.SDHA在肾透明细胞癌组织中的表达差异及其对患者预后的影响通过TCGA数据库提取的关于SDHA基因在肾透明细胞癌组织中的表达数据,我们发现与正常肾组织相比,SDHA m RNA在肾透明细胞癌组织中呈现低表达状态;生存分析结果表明SDHA低表达组肾癌患者的生存时间低于SDHA高表达组肾癌患者的生存时间。Western blot检测SDHA蛋白在肾透明细胞癌组织中同样呈现低表达状态。免疫组化实验结果显示:与癌旁正常肾组织相比,SDHA蛋白在肾透明细胞癌组织中呈低表达状态。3.SDHA可抑制肾癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力我们构建了SDHA过表达质粒,转染内源性低表达SDHA的肾癌细胞系786-O和ACHN,应用G418筛选了稳定表达SDHA的细胞克隆。CCK8细胞增殖实验和Brd U细胞增殖实验结果均表明,转染SDHA过表达质粒后,与对照组细胞相比,肾癌细胞的增殖能力明显下降。Transwell实验及划痕愈合实验结果表明,转染SDHA过表达质粒后,与对照组细胞相比,786-O和ACHN细胞细胞的细胞迁移和侵袭能力也明显受到抑制。4.过表达SDHA对Wnt/β-catenin信号通路的影响及表型回复实验过表达SDHA可明细下调Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白p-GSK-3β,β-catenin,和c-Myc的蛋白表达水,Western blot回复实验结果表明,SDHA对wnt/β-catenin信号通路的抑制作用可明显被Li Ci试剂（Wnt/β-catenin信号通路激活剂）所有拮抗。表型回复实验结果进一步证明SDHA通过抑制Wnt/β-catenin信号通路而抑制肾癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。5.裸鼠成瘤实验检测在体内环境下SDHA对肾癌细胞增殖能力的影响裸鼠成瘤实验结果显示SDHA过表达组小鼠的移植瘤较对照组小鼠的移植瘤生长更慢,体积更小。Western blot技术检测移植瘤组织中蛋白表达实验结果显示SDHA过表达组的小鼠肿瘤较阴性对照组小鼠肿瘤中E-cadherin蛋白表达量更高,而N-cadherin、MMP-9和PCNA蛋白表达量更低。6.统计分析本研究中的统计分析采用SPSS 19.0软件进行,根据实验的设计、实验数据的数据类型,合理选用t-检验、配对样本t-检测、方差分析、卡方检验等统计分析方法对实验数据进行统计分析。P<0.05被判定为实验结果差异具有统计学意义。结论:1、生信分析及免疫组化结果显示SDHA在肾透明细胞癌中呈现低表达状态,生存分析结果表明,SDHA低表达组肾透明细胞癌患者的生存时间低于SDHA高表达组的患者。2、细胞水平过表达SDHA能够显著抑制肾癌细胞增殖、迁移、和侵袭能力。3、SDHA通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制肾癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。