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目的：程序性细胞死亡包括凋亡和自噬性死亡,越来越多的研究表明自噬在肿瘤中起重要作用。Beclin 1与Ⅲ型PI3K结合启动自噬的发生,Bcl-2/Bcl-xL结合Beclin 1阻断其自噬诱导功能。Bcl-2/Bcl-xL等在鼻咽癌中高表达且与其预后呈负相关。鼻咽癌以放疗为主,放疗除了诱导凋亡还能诱导自噬,在抗肿瘤中起重要作用。Apogossypolone (ApoG2)是经过改造的棉酚衍生物,它是一种新型的抗凋亡Bcl-2家族蛋白的小分子抑制剂。我们研究发现ApoG2能与Bcl-2/Bcl-xl结合,在鼻咽癌细胞中阻断Bcl-2的功能,并在体内外增强化疗敏感性；还发现抗癌药物、射线等调控Beclin 1的表达诱导鼻咽癌细胞自噬性死亡。本课题拟进一步研究ApoG2抑制Bcl-2/Bcl-xL与Beclin 1的结合,阻断Beclin 1诱导自噬的功能,体内外增强放射线诱导鼻咽癌细胞自噬性死亡以及放疗敏感性,为Bcl-2小分子抑制剂类型的抗肿瘤药物联合放射治疗鼻咽癌提供实验依据,同时为将ApoG2研发成新型的抗肿瘤药物奠定基础。方法：体外培养人鼻咽癌CNE1、CNE2和SUNE1细胞及鼻咽上皮细胞NP69,MTT法检测不同浓度Bcl-2抑制剂ApoG2对人鼻咽癌CNE1、CNE2和SUNE1细胞的抑制作用及对鼻咽上皮细胞NP69的细胞毒作用,计算各自的IC50值,选择低于IC50的药物浓度作为后续实验浓度。克隆形成实验检测不同剂量放射线加或不加ApoG2对人鼻咽癌CNE1、CNE2和SUNE1细胞生存曲线的影响,计算其存活率,绘制细胞存活曲线。免疫共沉淀法检测ApoG2对Beclin 1和Bcl-2结合的影响。慢病毒感染CNE2细胞,Knock down Atg5,建立稳定细胞株,观察自噬的缺失对ApoG2引起的鼻咽癌细胞放疗增敏的影响。GFP-LC3质粒转染肿瘤细胞,荧光显微镜观察自噬标志物LC3的聚集。透射电镜检测细胞自噬形态。免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白LC3、P62的表达。建立裸鼠移植瘤模型,观察ApoG2口服、单独放疗及两者联合对鼻咽癌细胞移植肿瘤的生长抑制作用；免疫组化检测移植瘤组织中LC3表达的变化。结果：1. ApoG2可增强CNE1、CNE2、SUNE1细胞的放射敏感性MTT结果显示Bcl-2抑制剂ApoG2对人鼻咽癌CNE1、CNE2、SUNE1细胞均具有增殖抑制作用,呈剂量依赖性,IC50值分别为2.84、2.18、5.64μM。对正常鼻咽上皮细胞无细胞毒作用。体外克隆形成实验分析显示,CNE2细胞中放疗+ApoG2不同浓度组的剂量效应因子(DEF)值均大于1,分别为1.92、1.52和1.13。ApoG2可以提高放射增敏作用,并且放射增敏效果呈药物剂量依赖性。2. ApoG2可促使Bcl-2与Beclin 1解离Beclin 1是一种BH3-only蛋白家族成员,起初被鉴定为Bcl-2相互作用蛋白,也是第一个被发现的哺乳动物自噬相关基因,在肿瘤的发生发展中起关键作用。免疫共沉淀检测结果显示ApoG2可与Beclin 1竞争性抑制Bcl-2,从而促使Bcl-2与Beclin 1解离。3. ApoG2可诱导鼻咽癌细胞发生自噬激光共聚焦显微镜观察可见ApoG2及放射处理后的转染GFP-LC3质粒的CNE2细胞内,LC3呈现明显的点状聚集,且ApoG2联合放射可以增加LC3的点状聚集,对照组胞浆内LC3呈均匀弥散分布；透射电镜观察2Gy放射联合20μMApoG2组照射48 h后可观察到自噬小体的形成。Western blot检测可见放疗组和ApoG2组均出现LC3的表达,而ApoG2联合放疗可以显著增加LC3的表达；并呈时间剂量依赖性。提示ApoG2联合放疗可进一步诱导鼻咽癌细胞发生自噬。流式细胞术检测细胞坏死,结果显示ApoG2联合放疗处理可以诱导CNE2细胞发生凋亡和坏死。4. knock down Atg5可抑制CNE2细胞自噬的发生,并提高ApoG2+放疗组的克隆形成率建立Atg5 knock down CNE2细胞株,Western blot检测到与VEC组(转染空载体)相比shAtg5组(转染质粒shAtg5)中Atg5的表达被抑制。Western blot检测ApoG2不能诱导shAtg5细胞发生自噬。克隆形成实验检测放疗、ApoG2处理及两者联合处理VEC组和shAtg5组细胞的细胞存活率,shAtg5组细胞存活率明显高于VEC组,细胞死亡率平均从67%升至82%。5. ApoG2可抑制裸鼠移植瘤的生长建立荷人鼻咽癌细胞的裸鼠放疗增敏模型,与对照组对比,ApoG2联合放射线可减小裸鼠的瘤体积及瘤重。ApoG2组、放疗组、ApoG2+放疗组对CNE 2裸鼠移植瘤生长的抑制率分别是46.89%、19.34%和61.64%。免疫组化结果显示ApoG2联合放射可增加瘤组织中LC3的表达。结论：1. ApoG2可诱导鼻咽癌细胞发生自噬。2. ApoG2可增强鼻咽癌细胞对放疗的敏感。3. ApoG2可促使Bcl-2与Beclin 1解离,游离出的Beclin 1活化下游自噬信号通路,这可能是ApoG2提高放射增敏作用的机制。4. ApoG2联合放疗可显著抑制裸鼠(CNE2细胞)移植瘤的生长。