漆酶是存在于植物中的一个重要酶,其底物具有广泛性。苹果（Malus domestica）是典型的呼吸跃变型果实,采后苹果在长期低温贮藏后或从低温贮藏结束转移到货架后易发生虎皮病,症状表现为果皮褐变,严重降低了果实的商品价值。尽管国内外进行了大量研究,但苹果虎皮病发生过程中的褐变机理尚不完全清楚。研究表明,DPA（diphenylamine）和1-MCP（1-methylcyclopropene）处理能有效抑制苹果虎皮病的发生,而这些处理对苹果次生代谢物质和漆酶的影响尚未见报道。本文以两个易发虎皮病品种‘Red delicious’和‘Cortland’苹果为材料,首先对采后苹果虎皮病发病过程中的代谢物进行了研究,以探索相关代谢物与采后苹果虎皮病的相关性;随后探讨了漆酶在苹果虎皮病发生过程中的表达规律,以及DPA和1-MCP处理对苹果漆酶活性及基因表达的影响,以揭示苹果漆酶及相关代谢化合物在虎皮病发病过程中的作用。荔枝（Litchi chinensis Sonn）是典型的非呼吸跃变型果实,采后荔枝极易失水发生褐变,严重影响了荔枝的货架期和商业价值。课题组前期研究表明,漆酶是荔枝果皮褐变的关键酶,通过催化表儿茶素与花色素苷协同反应的模式参与果皮褐变,因此对荔枝果实发育过程中漆酶底物的积累规律及其相关基因表达模式的分析,有助于进一步理解荔枝果皮褐变机理。此外,失水导致荔枝果皮褐变,促进漆酶活性的提高,而果实外果皮覆盖着的蜡质膜有助于防止水分散失。因此,本文还从蜡质层的角度,探讨了采后荔枝果皮褐变与表皮蜡质的关系,并进一步研究了荔枝蜡质合成关键基因WAX2的功能。主要研究结果如下:1.采后苹果虎皮病代谢组学研究在苹果冷藏期间共检测到545种代谢化合物,目前已鉴定出57种化合物,其中10种代谢化合物在虎皮病发病、DPA和1-MCP处理的苹果组织中呈极显著性的差异,分别为甘油酸、肉桂醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4-二羟肉桂酸、肉桂酸肉桂酯、甲基熊果苷、3,2’,4’,6’-四羟基-4-甲氧基-3’,5-二丙基二氢胆碱酯、5,7,4’-三羟基黄烷酮-7-O-阿拉伯糖基葡糖苷、槲皮素-3-芸香糖苷、鼠李糖素-3-新橙皮苷。PCA分析表明,苹果品种、DPA和1-MCP处理、贮藏时间四个因子之间存在显著性的差异,占总体差异的72%,其中6-甲基-5-庚烯-2-酮、4-O-咖啡酰奎宁酸、鼠李糖素-3-新橙皮苷、槲皮素-3-芸香糖苷、3-O-β-D-吡喃半乳糖基原花色素A5’、矢车菊素-3-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷等可能与苹果虎皮病的发生存在密切的关系。两个苹果品种中6-甲基-5-庚烯-2-酮、4-O-咖啡酰奎宁酸、鼠李糖素-3-新橙皮苷、槲皮素-3-芸香糖苷、3-O-β-D-吡喃半乳糖基原花色素A5’、矢车菊素-3-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷的含量在虎皮病发病过程中呈增加的趋势,而这些酚类化合物的含量在DPA和1-MCP处理的苹果中呈下降的趋势。表明六种代谢化合物可能在虎皮病发生过程中起重要的作用。LC-MS分析推测,4-O-咖啡酰奎宁酸可能与苹果漆酶发生反应,与虎皮病发生过程中的褐色物质的形成有关。2.采后苹果虎皮病与漆酶及酚类物质含量的关系在‘Red delicious’和‘Cortland’苹果中克隆得到多个漆酶基因,发现与荔枝、拟南芥漆酶具有较高的同源性。在两个苹果品种中,对照果皮中的Md LAC7（Laccase,LAC）的表达量随冷藏时间的延长呈明显上升的趋势,尤其是在冷藏7个月时,表达量大幅度增加。DPA和1-MCP处理对‘Cortland’苹果果皮中Md LAC2、7的表达量存在显著性差异。‘Red delicious’苹果果皮中Md LAC12、14、15、16的表达量呈下降的趋势,DPA和1-MCP处理均能明显抑制‘Cortland’苹果果皮中Md LAC7、9、14的表达以及‘Red delicious’苹果果皮中Md LAC7、9、12、14的表达。DPA和1-MCP处理对‘Cortland’果皮中Md LAC12、15、16的表达量不存在显著性的差异。对照的苹果漆酶活性随贮藏时间的延长呈增加的趋势,而DPA和1-MCP处理明显抑制了漆酶的活性。苹果果皮中的酚类化合物含量在采后贮藏期间呈逐渐下降的趋势,但是绿原酸含量呈逐渐增加的趋势。在冷藏4个月,DPA处理能够诱导根皮苷、芦丁、花色素苷含量的增加,在鉴定到的酚类化合物中,两个苹果品种中表儿茶素的含量明显高于绿原酸和儿茶素,但是DPA和1-MCP处理对绿原酸、儿茶素和表儿茶素的含量不存在显著性差异。PCA分析表明,苹果虎皮病与根皮苷含量变化呈负相关,与绿原酸含量变化呈正相关,但在‘Red Delicious’品种中与儿茶素含量变化呈正相关。这些结果表明,漆酶和酚类物质在苹果虎皮病发病过程中可能起重要的作用。3.荔枝果皮褐变关键酶-漆酶底物的分离纯化及其积累规律在荔枝果实发育过程中,原花青素类物质和儿茶素类物质已经在幼果中大量合成,这些化合物的含量随着果实发育呈逐渐下降的趋势,与荔枝果皮中Lc LAR和Lc ANR表达量的下降趋势相一致,推测Lc LAR和Lc ANR是儿茶素生物合成途径中的两个关键基因。Lc LAC在荔枝幼果中表达量高,而在果实成熟时表达量较低。漆酶能催化表儿茶素反应并形成表儿茶素二聚体。荔枝果皮提取液经葡萄糖凝胶柱LH-20分离,得到P1-P4四个组分,采用HPLC-Q-TOF-MS/MS方法对P1-P4组分中的化合物种类进行了鉴定,发现在P3组分中鉴定出一种B型和一种A/B复合型表儿茶素三聚体,在P4组分中鉴定出一种B型和两种A/B型表儿茶素三聚体。分别在P1和P2组分中鉴定出表儿茶素和原花青素B2。首次在荔枝果皮中鉴定出两种B型表儿茶素三聚体（Litchitannin B1和Litchitannin B2）。这些结果表明,低聚合度的表儿茶素可能作为荔枝漆酶的底物。4.荔枝果皮褐变与表皮蜡质的关系课题组前期研究表明,荔枝失水导致果皮褐变并促进漆酶活性的提高。而果实外果皮覆盖着的蜡质膜有助于防止水分散失,但是荔枝果皮褐变与表皮蜡质的关系鲜有报道。荔枝蜡质总量呈先升高后下降的趋势,在开花后60 d大量积累,但桂味蜡质总量高于糯米糍;扫描电镜表明,蜡质在开花后60 d大量沉积,糯米糍在果实成熟时,蜡质层形成凸起,蜡质覆盖在上面,容易脱落,而桂味蜡质形成交叉的网状结构,不易脱落;采后贮藏的各项生理指标表明,糯米糍失水快、蜡质总量下降快,褐变快,不耐贮藏;但包装均能延缓两种荔枝果皮的褐变。克隆了参与荔枝蜡质合成的Lc KCS、Lc KCR、Lc LACS、Lc CER1、Lc WAX2、Lc ECR、Lc FAH2和Lc WIN1的ORF序列;它们分别与其它物种中参与蜡质合成的基因有较高的相似性。基因表达结果表明,荔枝发育期间果皮中Lc CER1、Lc WIN1、Lc WAX2表达模式与蜡质总量的变化趋势相一致,可能在荔枝蜡质合成中起重要的作用;贮藏期间,当果皮开始失水或失水较严重,对照果皮中Lc KCS、Lc ECR、Lc LACS、Lc WAX2、Lc WIN1的表达量明显高于包装,对失水敏感,表明这些蜡质合成相关基因响应果皮失水逆境,在延缓荔枝果皮失水与褐变中起作用。5.荔枝果皮蜡质合成关键基因Lc WAX2功能的研究利用Clustal X和MEGA6.0软件对Lc WAX2蛋白的氨基酸序列进行了分析,发现Lc WAX2蛋白含有六个跨膜结构域,与Rc WAX2的同源性高达99.57%。利用农杆菌介导法注射烟草表皮细胞,Lc WAX2定位于内质网中。构建了稳定遗传表达载体p B2GW7-Lc WAX2,利用转基因技术获得过量表达Lc WAX2的转基因番茄。利用荧光定量技术检测了番茄阳性植株的Lc WAX2的表达量,发现只成功筛选出2个株系（OX-Lc WAX2-1和OX-Lc WAX2-2）,OX-Lc WAX2-1和OX-Lc WAX2-2的表达量分别是对照组的8倍和4.5倍。OX-Lc WAX2-1和OX-Lc WAX2-2的蜡质总量分别是野生型（WT）的1.94倍和1.78倍。利用GC-MS法对番茄果实蜡质成分进行了分析,表明蜡质主要由烷烃、醛类物质、酮类、初级醇、脂肪酸等化合物组成。OX-Lc WAX2-1和OX-Lc WAX2-2中烷烃物质含量分别是野生型的2.27倍和2.07倍。过表达的Lc WAX2有效降低了番茄果实的失重率。这些结果表明,Lc WAX2基因参与烷烃类物质的合成,可能在延缓荔枝果皮失水及褐变中起的作用。